SD乳鼠原代心脏成纤维细胞培养及鉴定*

杨艳，欧阳伟炜，苏胜发，马筑，李青松，耿一超，卢冰

(1.贵州医科大学附院 肿瘤科，贵州省肿瘤医院 肿瘤科，贵州 贵阳 550004; 2.贵州医科大学 肿瘤学教研室，贵州 贵阳 550004)

成纤维细胞是疏松结缔组织中最主要的细胞，可分泌多种生长因子调节细胞增殖及分化。成纤维细胞是心脏组织的主要组成成分，相关研究发现出生后1 d时大鼠心脏成纤维细胞约占30%，出生后15 d时则约占64%[1]。成纤维细胞主要是通过合成及分泌胶原蛋白、纤连蛋白等细胞外基质，提供给心脏一个完整的网状支撑系统，在维持心脏结构、功能、生物化学和电机械信号转导中发挥重要作用[1-3]。心脏成纤维细胞已用于心肌梗死后心脏纤维化、缺血缺氧再灌注、血管重构等体外研究模型，是目前研究心血管疾病的方法之一[4-6]。鼠心脏成纤维细胞培养方法主要包括酶消化法及组织块贴壁法。酶消化法主要包括胰蛋白酶消化、蛋白酶消化过夜再用Ⅱ型胶原蛋白酶消化以及蛋白酶混合Ⅰ型胶原酶联合消化，分别用胰酶、Ⅱ型胶原酶依次消化分离心肌组织，再通过两次差速贴壁分离法等。在实验中所采用酶种类、浓度、顺序、消化时间及次数，是否水浴过夜、差速贴壁的次数、消化程度等均有所不同，本实验采用两种酶混合短时间多次消化的方法进行消化分离心脏成纤维细胞，通过观察培养的乳鼠心脏成纤维细胞、探讨其在胸部放射治疗中导致心脏放射性损伤的机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1动物 出生24 h SPF级SD大鼠乳鼠30只，雌雄不限，体质量(6±0.5)g，实验动物由贵州医科大学动物实验中心提供。

1.1.2主要仪器和试剂 超净工作台，4～20 ℃冰箱，5% 37 ℃的CO2培养箱，倒置显微镜，细胞离心机，细胞爬片。DMEM高糖培养基(gibco公司，美国)、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(gibco公司，美国)，0.2%胶原酶Ⅱ(Sigma 公司，美国)、兔抗Vimentin单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)、山羊抗鼠二抗(北京中杉金桥有限公司)。

1.2 方法

1.2.1取材 将SD乳鼠置于75%酒精缸中浸泡10 s，剑突向上剖开胸腔、暴露心脏，用无菌眼科剪剪取心尖置离心管的PBS液中冰冻，将取好的心脏组织转移至细胞培养房的超净工作台中，用预冷的PBS漂洗3～5次后放入已灭菌的青霉素小瓶中，充分剪碎心脏成糜肉状，再次漂洗3～5次，将糜肉状的心脏组织平均分装至5～6支15 mL离心管中。

1.2.2酶消化分离培养 将消化酶与剪碎的心脏组织体积按1 ∶3的比例加入15 mL离心管中，加入0.25%胰蛋白酶及0.2% Ⅱ型胶原酶以1 ∶1混合，吹打30～60 s封口后转移于37 ℃恒温水浴锅中充分震荡摇晃8～10 min，用无菌吸管吸取上清后用100目的筛网过滤；将收集的上清液放入15 mL离心管，并加入同体积的细胞培养液。将15 mL离心管中未消化的组织再次加入消化酶并吹打30～60 s后再次转移至于37 ℃恒温水浴锅中充分震荡摇晃8～10 min后吸取上清，同法消化3～5次至组织消失，仅剩下白色透明的胶原纤维组织。

1.2.3细胞培养 将分次收集的细胞悬液以1 000 r/min，5 min离心2次，弃掉上清液，加入10%胎牛血清高糖DMEM 5 mL重悬细胞，调整细胞密度后接种到25 mL培养瓶中。移到5% 37 ℃的CO2培养箱中培养90～120 min，差速贴壁后，将细胞悬液转移至6孔板中继续培养心肌细胞，补充10%胎牛血清高糖DMEM于培养瓶中，再置于5% 37 ℃的CO2细胞培养箱中培养，2 d换1次培养液。当心脏成纤维细胞生长铺满瓶底体积达 80%～90%时，用2.5 g/L 胰蛋白酶1 mL消化细胞进行传代。

1.2.4心脏成纤维细胞鉴定 (1)形态学观察，将培养的原代心脏成纤维细胞在0、24、48及72 h时间点用100倍数倒置相差显微镜观察原代成纤维细胞形态学特征。(2)Vimentin免疫组化染色鉴定，选2～4代的心脏成纤维细胞，按5X104接种于置有细胞爬片的12孔板中，于5% 37℃的CO2培养箱中培养48～72 h。用多聚甲醛固定40 min，H2O2室温孵育30 min，Tritonx-100通透30 min，BSA室温封闭。加入200 μL不同浓度的Vimentin抗体，置于4 ℃冰箱孵育过夜，加入100 μL二抗，室温孵育30 min。DAB闭光染色，苏木素复染。将细胞爬片通过不同浓度梯度的酒精脱水。用二甲苯透明，中性树胶封片。染色完成后立即进行倒置显微镜观察细胞染色。

2 结果

2.1 心脏成纤维细胞的生物学特性

培养90～120 min时可见较多贴壁的成纤维细胞，在倒置显微镜下呈球形亮点或已贴壁生长的细胞(图1A)；24 h后细胞逐渐由圆形伸展为三角形、扁平形、长梭形及不规则多边形，且贴壁细胞数量增多(图1B)；培养2 d后可见成纤维细胞数量较前增多，形态多样且轮廓清晰，部分有多个伪足突起，细胞核边界清楚，核仁明显，细胞增殖能力增强，生长加速(图1C)；第3天时细胞数量明显增加，细胞铺满瓶底70%以上，部分区域细胞互相汇合无空隙，细胞形态以长梭形、不规则多边形为主(图1D)。因消化后心脏组织内多种细胞会混合生长，部分区域细胞可见成簇生长，呈扁平状排列，可能为内皮细胞。培养的原代成纤维细胞中可见散在的细胞呈长梭形，折光性更强；有时可见细胞搏动，为心肌细胞(图1B、图1C及图1D)，因心肌细胞为不可再生细胞，一般传至第二代后则以成纤维细胞为主。

注： A～D分别为培养2、24、48及72 h。箭头所示为心肌细胞。 图1 原代培养的成纤维细胞(100×)Fig.1 The primary culture of cardiac fibroblasts at different time points under phase contrast microscope(100×)

2.2 心脏成纤维细胞纯度

培养的细胞经vimentin 免疫组化染色后在倒置显微镜下可见细胞质染为黄色，细胞核染为紫色，染色率达90%以上(图2)，提示细胞纯度较好。

2.3 培养过程中的细胞污染

本实验在原代细胞培养48 h时出现细菌污染(图3A、B)，图A显示为支原体污染，菌体呈线状或多形性，图B显示为黑蛟虫污染，呈黑点状，培养基混浊，细胞形态发生改变，甚至裂解死亡。

3 讨论

心脏主要由成纤维细胞、心肌细胞、血管内皮细胞及血管平滑肌细胞等组成。心脏成纤维细胞是心脏纤维化的关键效应细胞[7]心脏成纤维细胞的迁移及增殖能力极强，与心肌纤维化的发生发展息息相关[8-10]，与多种心脏疾病发生发展相关，如高血压性心肌肥厚、肥厚性心肌病、缺血性心肌病以及放射性心脏损伤等，故建立一种稳定、有效的体外心脏成纤维细胞对临床心血管疾病的研究、防治有着深远意义。

图2 免疫组化检测Vimentin在成纤维细胞表达(100×)Fig.2 Immunohistochemical detection of Vimentin expression in cardiac fibroblasts(100×)

注：图A箭头所示为支原体污染(台盼蓝染色)，图B箭头所示为黑蛟虫污染。图3 原代培养48 h时细菌污染结果(100×)Fig.3 Bacterial contaminationat primary culture 48 h(100×)

目前关于心脏成纤维细胞的原代培养方法较多，大多都是从成年鼠或乳鼠心脏中分离培养[11-15]，也可从胚胎鼠心脏中分离培养心脏成纤维细胞[16]，较为常用的是酶消化法及组织块贴壁法。酶消化法包括单纯胰蛋白酶消化[17-18]、消化过夜再用Ⅱ型胶原蛋白酶消化[19-20]以及蛋白酶混合Ⅰ型胶原酶联合消化[14]。消化法是利用消化酶将基质、纤维等消化去除，从而使细胞分离出来。胰蛋白酶主要作用是分解蛋白质，对细胞膜破坏力强，消化细胞时若时间控制不好易造成细胞损伤。胶原酶以消化胶原为主，作用缓和。刘美丽等[21]取SD 成年大鼠心脏成纤维细胞，对不同消化酶组合及不同时间点进行比较，最后发现单用胶原酶消化60 min 所得细胞数量最多，且细胞状态佳、死亡率低、增值能力强等。

本研究在前期实验应用胰蛋白酶消化乳鼠心脏组织，消化时间较长且不完全，提取细胞数量较少，消化后细胞活力差，生长速度慢，提取的细胞贴壁后杂质较多，传代后细胞增值能力差且状态不佳。主要因为胰蛋白酶消化时间长且消化不完全，对已消化的细胞破坏强，导致细胞活力下降。后调整为胰蛋白酶及Ⅱ型胶原酶按1 ∶1混合置于37 ℃水浴箱中进行短时间多次消化，所提取细胞量多，且细胞生长快，约3～4 d时可生长约90%，细胞杂质少，传代后生长速度快，且细胞状态好。实验过程中无菌操作、细胞贴壁时间长短、细胞换液的频率、实验室环境也是影响原代成纤维细胞分离培养的重要条件。乳鼠生长的实验室安全级别达到要求，手术器械需要高压灭菌，超净台需要紫外线照射及75%乙醇等提前消毒，乳鼠浸泡75%乙醇中时间约10 s为佳，取出的心脏组织需置于冰盒中PBS液中冰冻以减少心脏缺血缺氧损伤时间，冰冻的心脏组织清洗杂质后尽快提取细胞。实验过程污染与无菌操作不规范及实验室环境相关。刘姿麟等[22]养大鼠血管平滑肌过程中出现霉菌污染。总之在细胞培养过程中每一步均需严格遵照无菌操作流程。

本研究通过不断反复实验及调整实验方法、条件等，通过观察心脏成纤维细胞体外培养生长情况及培养的第二代成纤维细胞并经Vimentin免疫荧光鉴定，证实本研究在实验室成功建立了一种稳定、有效的原代成纤维细胞培养方法。为后续实验顺利进行奠定基础。