核酸内切酶G在帕金森病大鼠脑组织中的表达及意义*

武林，任真奎, 吕菊, 谢鹏, 胡玉梅, 吴昌学**，禹文峰**

(1.黔西南州人民医院 输血科，贵州 兴义 562400； 2.贵州医科大学 分子生物学重点实验室，贵州 贵阳 550004； 3.贵州医科大学 地方病与少数民族疾病教育部重点实验室，贵州 贵阳 550004； 4.黔西南州人民医院 检验科，贵州 兴义 562400)

帕金森病 (parkinson's disease, PD) 又称为震颤性麻痹，是居于阿尔茨海默病后的中枢神经系统退行性疾病[1]，其病理基础主要是多巴胺能神经元进行性变性丢失。研究表明，细胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)在PD的发生发展过程中起着重要作用，尤其是细胞凋亡更被认为是PD病理机制中多巴胺能神经元死亡的主要方式之一[2-4]。以往的研究表明，Caspase依赖型凋亡在这一过程中起重要作用，但最近有越来越多的研究表明非Caspase依赖型凋亡也参与了巴胺能神经元死亡[5-6]。核酸内切酶G(endonuclease-G，Endo-G)是一种Mg2+依赖非特异性核酸内切酶，是非Caspases依赖性凋亡通路的重要作用因子；严重的氧化应激、细胞内的钙超载以及缺血过程中能够诱导Endo-G从线粒体释放到胞浆中，并随即转位至胞核中，导致核小体DNA碎片化，诱导细胞凋亡[7-8]。本实验通过研究在6-羟多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)诱导建立的PD大鼠模型中Endo-G表达及转位情况，探讨Endo-G介导的非Caspase依赖型凋亡在巴胺能神经元变性丢失过程中的作用和分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF级雄性SD大鼠[SYXK(黔)2018-0001]由贵州医科大学实验动物中心提供，阿扑吗啡、6-羟基多巴胺和抗坏血酸购自美国Sigma公司，Endo-G抗体、Cox-4抗体、H3抗体和山羊抗小鼠抗体购自美国Santa公司，BCA试剂盒和细胞核蛋白提取试剂盒购自美国Thermor公司，ABC免疫组织化学试剂盒购自美国Vector公司，线粒体提取试剂盒购自英国Abcom公司。

1.2 方法

1.2.1实验动物及模型建立 30只SPF级雄性SD大鼠适应性饲养1周后，随机分为PD模型组(PD组)和假手术组(Ctrl组)，每组15只。通过立体定位仪向PD组大鼠右侧纹状体(A/P 为1 mm，L/M 为3 mm，D/V 为-5 mm)注射6-OHDA(5 g/L，溶于含0.02%抗坏血酸的生理盐水中)4 μL诱导建立单侧损毁PD大鼠模型；Ctrl组则注射生理盐水(含0.02%抗坏血酸)4 μL作为对照[9]。术后第3周，通过阿扑吗啡 (apomorphine, APO )诱导的旋转行为学实验对6-OHDA诱导的PD大鼠模型进行筛选，即腹腔注射APO(APO 2 mg /kg溶于生理盐水中)诱发大鼠向健侧旋转，记录40 min内向健侧旋转圈数圈速>2 r/min的大鼠视为成功的PD模型大鼠[10]。

1.2.2蛋白印迹实验(Western Bolt)检测大鼠黑质线粒体内和细胞核内Endo-G的表达 术后第四周，将大鼠断颈处死，迅速取出大脑并分离出左、右侧黑质，用线粒体蛋白提取试剂盒(ab-110169，abcom)提取大鼠黑质线粒体蛋白，用细胞核蛋白提取试剂盒(Pierce 78833，Thermor)提取大鼠黑质细胞核蛋白。采用BCA蛋白定量法对提取的黑质线粒体蛋白和细胞核蛋白进行定量，取10 μg蛋白变性后经12% SDS-PAGE电泳，再将蛋白转至0.22 μm PVDF膜上，经5% BSA封闭60 min后，滴加Endo-G一抗(1 ∶500，sc-365359，Santa)4 ℃孵育过夜，用0.1% TBST洗膜3次(5 min/次)后，加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1 ∶1 200，sc-2005，Santa) 室温孵育60 min，用0.1% TBST清洗3次(5 min/次)，最后进行ECL化学发光显影，线粒体内Endo-G表达量以COX-4为内参进行统计分析；细胞核内Endo-G表达量以Histone-3为内参进行统计分析。通过Endo-G免疫组化染色观察Endo-G在黑质区的表达与分布情况，黑质区Endo-G免疫染色阳性细胞中，神经元为空心视为未发生Endo-G核转移细胞，若神经元为实心视为发生Endo-G核转移细胞，统计各组黑质细胞中发生Endo-G核转移细胞占Endo-G阳性细胞数的比例(Endo-G核转移细胞率)。

1.2.3大鼠黑质内酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)和Endo-G的变化 术后第4周，用10%水合氯醛将大鼠麻醉后，打开胸腔暴露心脏，经左心室灌注生理盐水至肝脏变白后，再灌注4 %多聚甲醛(含0.1%苦味酸)至四肢、尾巴变黄后，取出脑组织放入含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液中固定24 h。梯度脱水，石蜡包埋，在大鼠中脑黑质区做4 μm连续切片。切片经脱蜡、水化后，用0.3%过氧化氢溶液孵育15 min以灭活内源性过氧化物酶活性，10%山羊血清封闭60 min；小鼠单克隆抗TH抗体(1 ∶300)或小鼠单克隆抗Endo-G抗体(1 ∶200)在4 ℃下孵育过夜，TBST洗3次(5 min/次)，山羊抗小鼠IgG(1 ∶500)室温孵育60 min，TBST洗3次(5 min/次)，ABC复合物室温孵育30 min，TBST洗3次(5 min/次)，DAB显色，脱水、透明，中性树脂封片后，显微镜下观察并采集图像。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠黑质内TH

Ctrl组TH染色阳性神经元结构完整，胞体饱满，边缘清晰；PD模型组大鼠损毁侧黑质部位TH染色阳性细胞很难见完整的神经元结构，难以见到完整的细胞轮廓；表明在PD模型大鼠损毁测区域黑质多巴胺能神经元发生变性和丢失。见图1。

图1 各组大鼠黑质内TH的表达(免疫组织化学染色)Fig.1 Expression of TH detected by IHC staining in the different groups(Immunohistochemical)

2.2 左、右侧黑质线粒体和黑质细胞核中Endo-G表达

Ctrl组中，左、右侧黑质线粒体和黑质细胞核中Endo-G表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。在PD组中，右侧黑质线粒体中Endo-G表达量较左侧明显下降(P<0.05)，右侧黑质细胞核中Endo-G表达量较左侧明显上升(P<0.05)。见图2、图3和表1。

注： L为左侧，R为右侧；(1)与左侧相比，P<0.05。图2 大鼠左、右侧黑质线粒体中Endo-G蛋白的表达Fig.2 Expression of Endo-G protein in mitochondria in the different groups

注： L为左侧，R为右侧；(1)与左侧相比，P<0.05。图3 大鼠左、右侧黑质细胞核中Endo-G蛋白的表达Fig.3 Expression of Endo-G protein in nucleus in the different groups

表1 左、右侧黑质线粒体和黑质细胞核中Endo-G表达量的变化Tab.1 Comparison of Endo-G protein expression in mitochondria and nuclei in two

2.3 Endo-G核转移率

Ctrl组Endo-G核转移细胞率(5.12±0.89)%低于 PD组(16.99±2.10)%，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

注：A为Ctrl组(100×)，箭头所示为未发生Endo-G核转移细胞；B为PD组(100×)，箭头所示为发生Endo-G核转移细胞；A、B右上角白框内图形为箭头所指区域的放大图(400×)；C为Endo-G核转移率；(1)与Ctrl组相比，P<0.05。图4 两组大鼠黑质细胞中发生Endo-G核转移细胞的比例Fig.4 Expression of Endo-G detected by IHC staining in two groups

3 讨论

PD是由于黑质多巴胺能神经元逐渐变性丢失而造成的中枢神经系统退行性疾病[12-13]。PD的病因与机制至今未明，研究表明凋亡参与了多巴胺能神经元变性丢失的过程[14-15]。凋亡为生理性的细胞清除，与有丝分裂相对应，是由基因控制细胞主动而有序死亡的过程[16-17]。根据半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)家族在凋亡中所起的作用，可将凋亡分Caspase 依赖型凋亡和非Caspase依赖型凋亡。Caspase依赖型凋亡即经典的细胞凋亡，非Caspase依赖型凋亡无Caspase活化，且不伴有明显的核染色质凝聚[18-20]。

Endo-G是一种Mg2+依赖的非特异性核酸内切酶，由核基因编码，在细胞质中翻译成前体蛋白，随后转运至线粒体中切割掉N端48个氨基酸变为成熟体[21-22]。在正常的细胞中，由于区室化作用，成熟的Endo-G位于线粒体膜间隙，不仅参与到mtDNA的修复和重组，而且还是细胞增殖所必需的，缺乏Endo-G的细胞将停滞在G2期，无法进入M期[23-24]。严重的氧化应激、细胞内的钙超载以及缺血过程中能够诱导Endo G自线粒体中释放到胞浆中，并随即转位至胞核中，导致核小体DNA碎片，介导非Caspase依赖型凋亡[25-26]。TH是将酪氨酸催化为多巴胺前体多巴的酶，特异性的存在于多巴胺能神经元中。因此，TH的免疫组化染色可以反映出多巴胺能神经元的损伤状况[11]。

本实验采用立体定位技术向健康雄性SD大鼠右侧纹状体内注射6-OHDA诱导建立单侧损毁PD大鼠模型，通过蛋白印记和免疫组化检测Endo-G在黑质区的表达和分布的情况，探讨Endo-G介导的非Caspases依赖性凋亡通路在PD发生发展过程中的作用。与假手术对照组相比，6-OHDA诱导损伤建立的单侧损毁PD模型大鼠损伤侧黑质线粒体中Endo-G含量显著下降，而细胞核中Endo-G含量显著升高；且免疫组化结果显示，在PD模型大鼠损伤侧黑质区域，Endo-G除分布于胞浆外，在细胞核也有大量分布。这些结果表明，在6-OHDA诱导的PD大鼠模型黑质中，Endo-G从线粒体转为至细胞核中，介导非Caspases依赖性凋亡。