一种猪流行性腹泻病毒阳性血清的制备方法

姚 尧 兆丰华生物科技（福州）有限公司 福州 350014

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒 (Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种急性、高度传染性肠道疾病，以呕吐、水样腹泻、脱水、哺乳仔猪高病死率为主要特征[1]。1978年，比利时首次分离鉴定出该病毒，命名为 CV777[2]。

近年来，猪流行性腹泻的流行区域逐渐扩大，PED的暴发给全球的养猪业带来了严重的经济损失。猪流行性腹泻诊断技术、诊断试剂以及疫苗等是该病防治的关键[3]。按照新兽药相关规定，该病活疫苗鉴别、效力、外源病毒等项目的检验和病毒筛查需要猪流行性腹泻病毒阳性血清。但是目前国内缺乏质量稳定的猪流行性腹泻病毒阳性血清。本研究通过用猪流行性腹泻病毒对试验用兔进行基础免疫，再用猪流行性腹泻病毒灭活疫苗对试验用兔进行3～5次免疫，而后无菌采集兔血清，经过检验、分装、冻干等工艺过程，并最终用于鉴别、效力、外源病毒等项目的检验和病毒筛查过程，不但能大大降低因用猪作为试验动物的制造高成本，同时也减小了因用猪制备阳性血清而引起的同源动物其他外源病毒污染的风险。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 110日龄兔，购于福建省连江玉华山自然生态农业试验场。

1.1.2 猪流行性腹泻病毒（PEDV）ZJ08株检测用抗原 由福州大北农生物技术有限公司生产，效价107.6TCID50/mL，批号为 BS2018005。

1.1.2 免疫用猪流行性腹泻病毒 （ZJ08株） 由福州大北农生物技术有限公司生产，批号为DZ20180705。

1.1.3 免疫用猪流行性腹泻病毒（ZJ08株）灭活疫苗 由福州大北农生物技术有限公司生产，批号为SY2018001。

1.2 方法

1.2.1 动物筛选 从福建省连江玉华山自然生态农业试验场采购的10只110日龄兔，按表1方法检测相关抗体。

表1 病原及抗体检验方法

1.2.2 免疫程序 用表1方法确定10只兔抗体均为阴性后，按表2对兔进行免疫。

1.2.3 血清的采集与分离 最后一次免疫后每10 d监测免疫后抗体水平的变化情况。当抗体水平满足要求时，采用无菌心脏采血法取血，1 500 r/min离心10 min，分离血清。

1.2.4 分装冻干 将混合均匀的血清在无菌条件下定量分装至安剖瓶中，冻干后抽真空封口。

1.2.5 血清的检验 物理性状、无菌检验、支原体检验、外源检验、真空度测定和剩余水分测定，按《中国兽药典》方法进行检测[4]。部分项目按表1方法进行检验。

1.2.5.1 中和抗体效价测定 将血清56℃灭活30 min后2倍系列稀释，选取适宜稀释度与猪流行性腹泻病毒ZJ08株200 TCID50/mL的病毒液等量混合，37℃下作用60 min后，每个稀释度接种长满Vero细胞单层的96孔细胞板6孔，每孔0.1 mL。同时设病毒对照6孔，阴性对照6孔，37℃、5%CO2培养箱中培养5 d，按照Reed-Muench方法计算血清的中和抗体效价。

1.2.5.2 特异性检验 将猪流行性腹泻病毒（ZJ08株）工作抗原稀释成200 TCID50/mL，与等量的猪流行性腹泻病毒阳性血清混合，置37℃中和1 h，接种长满Vero细胞单层的96孔细胞板6孔，100 uL/孔，即为中和组。同时设接种病毒的阳性对照6孔和接种健康细胞的阴性对照6孔，37℃、5%CO2培养箱中培养3～5 d，观察细胞病变。

1.2.5.3 细菌内毒素测定 按《中国兽药典》方法进行检测[5]。

2 结果与分析

2.1 动物筛选结果 10只兔按表1方法确定抗体均为阴性后，再按表2进行免疫后，随机抽取4只兔进行检测，发现血清中猪流行性腹泻病毒抗体效价随时间呈递增趋势，结果见表3。

表3 猪流行性腹泻病毒抗体水平监测结果

根据检测结果显示，最后一次免疫后30 d，随机抽取血清的中和抗体效价均在1：256以上，可以收获全部血清。

2.2 血清的检验结果

2.2.1 物理性状检验、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验和真空度测定 随机选取5支冻干血清，分别进行物理性状检验、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验和真空度测定[4]，结果均无菌生长、无支原体生长、无外源病毒污染，且物理性状和真空度检验均合格。

2.2.2 剩余水分测定 按文献 [4]方法进行测定，4份样品的剩余水分含量为 1.2%、1.3%、1.5%、1.1%，均小于4.0%，检验合格。

2.2.3 中和效价测定 随机抽取8支冻干血清，复溶后 56 ℃灭活 30 min，2 倍系列稀释至 1：64、1：128、1：256、1：512 后，接种长势良好的单层 Vero 细胞，测定中和抗体效价。结果见表4。

2.2.4 特异性检验 中和组、阴性对照组均不出现细胞病变，病毒对照组出现病变，检验合格。

表2 猪流行性腹泻病毒阳性血清免疫程序

2.2.5 细菌内毒素测定 每毫升血清的内毒素含量＜10EU。

表4 8支冻干阳性血清中和效价测定结果

3 讨 论

本研究旨在为猪流行性腹泻诊断技术、诊断试剂以及疫苗质量监控提供满足要求的猪流行性腹泻病毒阳性血清，这要求阳性血清应具有良好的特异性和足够高的中和效价。本研究以兔作为免疫动物，最终获得了中和抗体效价大于1：256的猪流行性腹泻病毒阳性血清（高于新兽药标准4倍），可满足于新兽药中猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻病毒活疫苗（HB08株+ZJ08株）的效力检验、鉴别检验和外源病毒检验。同时，用兔代替猪作为免疫动物，既降低了检验成本，又避免了因用同源动物制备阳性血清而引发的其他外源病毒污染的风险，适合大规模制备。