1型鸭疫里默氏菌的分离鉴定和药敏试验

郑小兰 程龙飞 黄 瑜

（福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福州 350013）

传染性浆膜炎是由鸭疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer，RA）引起的一种接触性传染性疾病，常常引起10周龄以内的鸭和鹅等水禽发病，临诊呈急性或慢性败血症过程，发病率多为10%～40%，最高可达70%，病死率为5%～80%，主要病理变化是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎等[1]。鸭疫里默氏菌是造成水禽发病和死亡的重要细菌性病原，该病在我国所有水禽养殖区均有发生，严重影响了我国水禽业的健康发展。鸭疫里默氏菌对药物的耐受力强，常出现双重或者多重耐药性[2-3]，使得药物的治疗效果大打折扣。因此，临床中应根据分离菌的药敏试验结果选择合适的药物进行治疗。我们从福州市及周边水禽养殖场分离到4株鸭疫里默氏菌，并进行血清型鉴定及药物敏感试验，为临床用药的选择提供了参考依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 病料来源 4个病例分别来自福清 （26日龄鹅）、连江（12日龄番鸭）、闽清（33日龄半番鸭）和闽候（22日龄鹅），发病率10%左右，病死率20%左右，剖检病变相似，均可见心包膜增厚并与胸骨粘连、肝脏肿大并覆盖有易撕脱的灰白色纤维素性假膜、气囊增厚并有数量不等的灰白色假膜沉积。

1.2 试剂及配制 EasyPure Viral DNA/RNA Kit、2×EasyTaq PCR SuperMix，北京全氏金生物科技有限公 司 产 品 ；tryptone、yeast Extract，OXOID 有 限 公 司产品；胎牛血清，Capricorn科学有限公司产品；药敏纸片，北京天坛药物生物科技有限公司产品；Tryptic soy Agar，美国BD公司产品。

LB 培养基：取 tryptone 10 g，yeast Extract 5 g和NaCl 10 g溶解于1 000 mL单蒸水中，调节pH值为7.4，分装，121℃高压灭菌 30 min。

TSA平板：取Tryptic soy Agar 4 g溶于100 mL单蒸水中，121℃高压灭菌30 min，自然冷却至60℃左右时，加入2%（V/V）胎牛血清，混匀后分装于平板。

1.3 细菌的分离 无菌条件下取脑组织，划线接种于TSA平板，37℃烛缸内培养24 h。挑取单个圆形、凸起、边缘整齐、半透明的菌落，划线于TSA平板，37℃烛缸内培养24 h，获得纯化菌。从纯化菌中挑取3~4个菌落接种于LB培养基，37℃、200 r/min振荡培养18 h。取少量纯化菌液按常规方法进行革兰氏染色并镜检。

1.4 细菌的种鉴定

1.4.1 核酸提取及定量 取纯化的菌液1 mL，8 000 r/min离心5 min，弃上清，按DNA/RNA Kit的操作规程提取核酸。取1 μL核酸以 NANODROP 2000测定其核酸浓度，调整到100 ng/μL作为模板。4株细菌分别进行。

1.4.2 PCR反应体系及程序 根据文献[4]合成下列引物，预期扩增片段为280 bp。

上游引物：RTF：5'-GGAGACGTAGGAGTAAGAGG-3'。

下 游 引 物 ：RTR：5'-CATGAAACCCCTACACCGTG-3'。

配制 50 μL的 PCR反应体系， 其中 2×Mix 25 μL，上下游引物（10 μmol/L）各 1 μL，模板 1 μL，ddH20 22 μL。PCR 程序：94℃预变性 5 min；94℃变性45 s，52℃退火 30 s，72℃延伸30 s， 循环 30次；72℃ 延伸 10 min。 取 PCR产物 4 μL以 1%琼脂糖凝胶（含GoldView）电泳，并用凝胶成像系统观察并拍照。

1.5 血清型鉴定 取纯化菌液20 μL滴于干燥洁净的载玻片，滴加鸭疫里默氏菌阳性血清10 μL，混匀并搅拌，静置2~3 min后观察，液体清亮并出现絮状沉淀，即判定为阳性。

1.6 药敏试验 纸片法进行药敏试验，取纯化菌的培养液均匀涂布于TSA平板，待菌液吸收后，将药敏纸片（本次试验共应用了23种药敏纸片）按一定间距摆放在平板上，37℃烛缸内培养24 h。量取每个药敏纸片抑菌圈的直径，按中国药检所制定的标准判定细菌对药物的敏感性。

2 结 果

2.1 细菌的分离 4个病例的病料接种培养后，在TSA平板上均可见大小、形态一致的菌落，菌落呈圆形、凸起于培养基、边缘整齐、半透明，45°角度肉眼观察有淡蓝色光泽。4个病例分离的菌株分别命名为FQ、LJ、MQ、MH。 4株菌经革兰氏染色、显微镜下观察，均为革兰氏阴性，无芽孢，呈小杆菌状。

2.2 细菌的PCR鉴定 以4株细菌的核酸为模板，经PCR扩增，均扩增出单一的PCR条带，片段大小约为280 bp（见图1），与预期的相符。

图1 4株细菌的PCR扩增产物电泳图

2.3 细菌的血清型鉴定 4株菌的菌液均与1型鸭疫里默氏菌阳性血清发生凝集，均不与2、6、7、10、11、13、14、17型阳性血清发生凝集，判定为1型鸭疫里默氏菌。

2.4 药敏试验 4株细菌的药物敏感试验结果见表1。所有菌株都表现出多重耐药性，耐受的药物都不低于6种，其中LJ株耐受的药物高达13种，说明鸭疫里默氏菌临床分离株的药物耐受性很强。4株细菌均耐受的药物有多粘菌素B、卡那霉素、林可霉素和青霉素。4株细菌均敏感的药物有氟苯尼考、强力霉素和壮观霉素，75%菌株敏感的药物有丁胺卡那霉素、头孢唑啉、左氧氟沙星和四环素等。

表1 各菌株的药物敏感试验结果

3 讨 论

鸭疫里默氏菌目前呈全球分布，血清型也在不断发展更新，2002年国际上公认有21种血清型，之后国内又有学者发现了新的血清型[5]。不同时期不同地区流行的血清型也不尽相同。本试验近期从福州及周边水禽养殖场分离的鸭疫里默氏菌均为1型，说明1型鸭疫里默氏菌仍是近期福州及周边流行的主要血清型，与前几年流行的以1、2和11型为主的情况略有差异[4]，应当引起重视。

鸭疫里默氏菌对药物的耐受性较强，不同时期不同地区分离的菌株，其药物敏感性不同。如黄美玲等从广东分离的菌株对四环素、环丙沙星、头孢噻肟高度敏感[6]，程冰花等从安徽分离的菌株对头孢类、喹诺酮类和氯霉素类药物的敏感性较高[7]。本次试验表明，4株1型鸭疫里默氏菌中，全部菌株敏感的药物有氟苯尼考、强力霉素和壮观霉素，75%菌株敏感的药物有丁胺卡那霉素、头孢唑啉、左氧氟沙星和四环素等。该结果提示，近期福州及周边区域传染性浆膜炎的预防和治疗药物，优先选择氟苯尼考、强力霉素和壮观霉素，丁胺卡那霉素、头孢唑啉、左氧氟沙星和四环素等也可供选择。