支气管肺泡灌洗液结核杆菌检测联合T-SPOT.TB 试验诊断菌阴肺结核的价值研究

陈廷宪 黄祖军 陈勇毅

培养法诊断结核具有较长时间周期，并且阳性率一直不高，在肺结核的诊断上显得相对迟缓。近年来，分子生物学得到了迅速的发展，核酸扩增等技术也在结核的诊断中得以应用，但因种种缺陷的存在，其灵敏度、特异性也不是十分理想，因此，采取有效措施，更加快捷、准确、有效地诊断结核病，显得十分重要。本研究前瞻性拟选取本院2018 年12 月—2019 年12 月收治的菌阴肺结核患者60 例作为研究组，另选取非结核性疾病患者60 例非结核受试者作对照组，均进行支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）结核杆菌检测及T 细胞酶联免疫斑点试验（T-SPOT.TB），分析支气管肺泡灌洗液结核杆菌检测联合T-SPOT.TB 试验诊断菌阴肺结核的临床价值，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院2018 年12 月—2019 年12 月收治的菌阴肺结核患者60 例作为研究组，纳入标准：抗结核治疗有效；以发热、咳嗽、咳痰、咯血、胸痛等非特异性症状就诊，无典型肺结核表现，干咳无痰或痰涂片抗酸染色阴性，快速培养无结核菌生长。研究组排除标准：排除其他非结核疾病。所有患者支气管镜检查前涂片找抗酸杆菌3 次阴性，1 次培养阴性。另选取非结核性疾病患者60 例非结核受试者作对照组。对照组中，女性17 例（28.33%）、男性43 例（71.67%）；年龄17 ～76 岁，平均年龄（52.15±13.41）岁。研究组中，女性15 例（25.00%）、男性45 例（75.00%）；年龄16 ～76 岁，平均年龄（51.62±11.57）岁。两组一般资料对比，差异无统计学意义（P ＞0.05）。

1.2 方法

所有研究对象均进行BALF结核杆菌检测及T-SPOT.TB试验。比较T-SPOT.TB 试验及支气管肺泡灌洗液结核杆菌检测单独使用及联合检测时诊断敏感度、特异度、诊断效率、阳性预测值、阴性预测值。（1）T-SPOT.TB 试验：采用酶联免疫斑点试验，使用结核感染T 细胞检测试剂盒，依照说明进行操作，分离制备人外周血单个核细胞，制成工作浓度细胞悬液，并连同抗原一同加至微孔培养板，在37.0℃和5%CO2培养环境下过夜，洗涤培养板并且滴加酶标抗体，再洗涤培养板后滴加底物反应液，进行SPOT计数，依照抗原A 或/和抗原B 孔反应情况，对结果作出判断：当阴性对照孔SPOT 数在0 ～5 之间时，阳性样本应为：（抗原A或抗原B 的SPOT 数）-（阴性对照孔SPOT 数）≥6；当阴性对照孔SPOT 数等于或超过6 时，阳性样本应为：（抗原A 或抗原B 的SPOT 数）≥2×（阴性对照孔SPOT 数）。（2）BALF 结核杆菌检测：根据患者病变部位对灌洗肺段加以选择，插入纤维支气管镜顶端至选好的肺段或亚段支气管开口位置，由活检孔给予2%利多卡因2 ～3 mL，局麻后再行注入37.0℃的生理盐水，共注入10 ～20 mL 生理盐水，注入完毕后立即吸引并回收BALF，可重复进行2 ～3 次并共收集15 mL 灌洗液。①BALF 涂片，采用萋-尼氏抗酸染色法，找到≥3 个抗酸杆菌/300 视野即判断为阳性；②使用罗氏固体培养法进行BALF 结核菌分离培养。③应用实时荧光定量核酸扩增（Xpert MTB/RIF）法检测灌洗液中结核分枝杆菌DNA。

1.3 观察指标

比较T-SPOT.TB 试验 及支气管肺泡灌洗液结核杆菌检测单独使用及联合检测时诊断敏感度（即真阳性率）。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0 软件对数据进行统计学分析，以例（%）表示计数资料，采用χ2检验，以（）表示计量资料，采用t 检验，并P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

60 例菌阴肺结核患者中，抗酸杆菌涂片阳性11 例，阳性率18.33%；结核菌培养（罗氏法）阳性31 例，阳性率51.67%；肺泡灌洗液TB-DNA 阳性49 例，阳性率81.67%，TB-DNA 阴性11 例中，4 例结核菌培养或抗酸杆菌涂片阳性。灌洗液抗酸杆菌涂片、培养、TB-DNA 三项联合检测，病原学总阳性率（49+4）/60=88.33%。60 例菌阴肺结核患者中，T-SPOT 阳性59 例，阳性率98.33%，T-SPOT 阴性1 例，阴性率1.67%。60 例非结核性疾病患者中，T-SPOT 阳性3 例（5.00%），阴性57 例（95.00%）。研究组T-SPOT 阳性率明显高于对照组（P ＜0.01）。T-SPOT.TB试验及支气管肺泡灌洗液结核杆菌联合检测提高了诊断敏感度，详见表1、表2。

3 讨论

肺结核曾经严重危害我国人民群众，且近年来耐药菌的问题日益严重。涂阳肺结核大约仅为发病例数的50%，菌阴肺结核的人数逐渐上升，给临床早期确诊和及时有效治疗造成了一定的困扰[1-2]。近年来，分子生物学取得飞速的发展，核酸扩增等技术的发展也很快，并且已经在结核诊断中有了一定的应用，但目前仅靠该类实验方法还难以达到很高的检测灵敏度和特异性[3-4]。

支气管镜检查作为一种辅助诊断肺结核的重要手段，能够直接获取细菌学依据，通过BALF 直接在病灶支气管肺泡内取材，使得检出结核分枝杆菌的机会增加，即使无痰的病例也可藉此进行检测[5-6]。T-SPOT.TB 试验是一种依靠特异性抗原，以酶联免疫斑点技术对结核进行诊断的新技术，资料显示其敏感性及特异性较高，它不会受到环境分枝杆菌或卡介苗接种的影响，并且受到患者免疫抑制的影响很小，即使HIV 感染的患者也依然适用，且其操作方法简便，检测周期较短，24 h 之内一般可获得检测报告，因此在临床上日益得到广泛的应用，在各类肺结核患者中均有应用[7-8]。因为支气管镜检查在临床上的应用非常广泛，因而对于肺结核的诊断，也提供了极有价值的参考[9-12]。结合通过电子支气管检查获得BALF，再通过相应方法来进行核酸检测，可使诊断的阳性率得到进一步提高，如廖明等[13]选择86 例疑似肺结核患者进行T-SPOT.TB、BALF-TbDNA、BALF 涂片、痰涂片、PPD、结核抗体检测，并对于T-SPOT.TB 与BALF-TbDNA 联合检测与单用检测、涂片法、PPD、结核抗体检测结果进行对比分析，结果血T-SPOT.TB、BALF-TbDNA 敏感性分别为84.8%、80.4%，特异性分别为80.0%、77.5%，两者联合检测敏感性达到100.0%，阳性预测值达97.1%，阴性预测值达100.0%，均优于单用检测（P ＜0.05），50 例肺结节病和123 例肺结核患者进行T-SPOT 和肺泡灌洗液T细胞亚群检测，结果肺结节病患者中T-SPOT 阳性率为4.0%，肺泡灌洗液CD3+、CD4+、CD8+T 细胞百分比分别为（88.79±5.34）、（63.58±20.56）、（27.42±6.76）%，CD4+/CD8+比值为（2.32±2.00）；肺结核患者中T-SPOT 阳性率为90.2%，肺泡灌洗液CD3+、CD4+、CD8+T 细胞百分比分别为（75.10±11.20）、（44.52±7.30）、（32.10±12.30）%，CD4+/CD8+比值为（1.30±1.20）。肺结节病患者较肺结核患者CD3+和CD4+T 细胞明显增多，CD4+/CD8+比值升高，差异均有统计学意义（P ＜0.05），CD8+T 细胞有所下降，但差异无统计学意义（P ＞0.05）；肺结核患者T-SPOT 阳性率明显高于肺结节病患者，差异均有统计学意义（P ＜0.05）。

表1 各检查方法在各组中的结果（例）

表2 各检查方法在60 例菌阴肺结核患者中的诊断敏感度对比 [例（%）]

本文则探讨了支气管肺泡灌洗液结核杆菌检测（同时行抗酸杆菌涂片、培养、核酸检测）联合T-SPOT.TB 试验诊断菌阴肺结核的价值，以期提高痰涂片及培养阴性的肺结核患者的结核分枝杆菌检出率，为菌阴肺结核的诊断提供依据。结果表明，联合检测较上述单独检查的诊断敏感度有显著提升（P＜0.01）。

综上所述，T-SPOT.TB 试验及支气管肺泡灌洗液结核杆菌联合检测提高了诊断敏感度，值得进一步研究、推广。