细胞自噬参与病毒免疫关键环节①

朱君瑶 翟永贞

(中国医科大学附属盛京医院感染科，沈阳 110004)

细胞自噬从被发现，到2016年大隅良典因其获得诺贝尔奖至今，一直都是细胞分子领域的研究热点，近些年细胞自噬相关的文章大量涌现，细胞自噬的多种生理功能被挖掘，其中在机体免疫方面的自噬的功能一直备受关注，研究表明自噬在机体免疫系统，包括免疫防御，免疫监视，免疫自身稳定方面均存在重要的意义[1-3]。自噬作为“降解”的一种途径，可以将大分子物质分解成可被再利用的小分子物质；或将已损坏或有害的物质清除以维持自身的稳态[4]，同时也是细胞重要的防御机制，面对病毒寄生的威胁，自噬拥有将寄生在宿主细胞内的病毒的蛋白质、核酸以及组装好的病毒颗粒包裹运送至溶酶体的能力[5]，这为自噬在抗病毒免疫中的作用奠定了重要基础。虽然目前对于自噬参与抗病毒免疫的机制仍未完全了解，但已有相关实验证明自噬参与病毒免疫，Liu等[6]利用果蝇模型，发现炎性依赖的干扰素刺激基因(stimulator of interferon genes，Sting)活化可以诱导抗病毒自噬限制寨卡病毒在果蝇大脑中的感染，这验证了自噬在病毒固有免疫方面的功能，同时自噬和干扰素协同作用也可以促进病毒的清除[7]，自噬在细胞因子的调控中发挥双重作用也成为一个新兴的研究课题[8]。此外自噬可被Toll样受体(Toll like receptor，TLR)信号诱导清除细胞内病原体[9]，协助吞噬细胞非特异性吞噬病毒，参与病毒抗原的加工提呈，同时自噬也参与了记忆型免疫细胞的形成和寿命的长期维持，应对抗病毒的持续感染或二次感染[10]。已有综述将自噬的抗病毒免疫作用从天然免疫和适应性免疫方面进行了概括性的叙述[11]，鉴于自噬在免疫应答中的多重作用(见图1)，本文主要对自噬在病毒感染免疫中参与的吞噬作用，抗原提呈，淋巴细胞的维稳和转化环节的研究进展作一综述。

1 自噬与吞噬作用

吞噬作用是细胞表面模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)识别并结合微生物表面的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)后，将胞外病原体内吞形成吞噬泡，与细胞中的内体融合形成成熟的吞噬泡，最终与溶酶体融合消化降解吞入的病原体的过程[12]。当病毒突破机体屏障结构进入皮肤或皮下组织，接触到周围存在的巨噬细胞，即被吞噬清除。值得注意的是，有研究发现除了对病毒实体的直接吞噬清除，吞噬细胞也可以通过吞噬凋亡细胞，即病毒感染后诱导凋亡的宿主细胞，来限制病毒的传播减轻病毒感染的病理损伤[13]。最新研究显示冬凌草甲酸可以通过激活TLR-4增强巨噬细胞的自噬来提高吞噬凋亡体的能力[14]，在此之前Bonilla等[15]在实验中通过观察自噬相关基因7(autophagy-related gene 7，Atg7)缺乏小鼠的巨噬细胞在结核分枝杆菌感染中的表现，发现自噬可以通过调整A类清道夫受体的数量来调节吞噬作用，两者的实验都阐述了自噬对巨噬细胞吞噬作用的直接调节作用。

图1 自噬参与免疫的多种途径Fig.1 Variety of immunity pathways involved by autophagy

近年来，不少学者发现自噬与吞噬之间存在协同作用且共享某些元件，两者在形成自噬体和吞噬体以及成熟方面高度相似。有实验显示，在相关TLR被激活后，含有内容物的单层膜吞噬泡可以迅速招募微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light-chain 3,LC3)，然后与溶酶体融合，加速吞噬细胞对被吞噬病原体的杀灭作用，此过程称为LC3相关吞噬作用(LC3-associated phagocytosis，LAP)[16]。值得注意的是，LC3是自噬过程重要的标志蛋白，自噬的启动有赖于LC3的脱乙酰化[17]，且LC3在自噬体膜的延伸和成熟中同样发挥着关键作用[18]。LAP与自噬均可被TLR激活，参与机体的固有免疫[16]，最新的研究显示LAP在对抗真菌感染以及原生动物寄生方面起到关键性作用[19,20]，但在病毒消除方面的直接作用尚未得到证实，相反有学者发现人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)可以利用LAP途径逃脱细胞的抗病毒防御，在产生细胞限制因子骨髓基质抗原2 (bone marrow stromal antigen 2,BST2)的细胞中，BST2可以限制包膜病毒例如HIV的释放，而HIV辅助蛋白Vpu(HIV-1 Viral Proteins U,Vpu)可以拮抗这一作用。Madjo等[21]研究发现LC3蛋白的其中一个亚型LC3C起到关键作用，实验观察到海拉(HeLa)细胞中LC3C是Vpu介导清除位于病毒出芽位点的BST2的关键分子，有趣的是，Vpu利用LC3C需要BST2的表达，与LC3C特异性结合，再与BST2结合，类似于激活LAP途径来促进BST2向胞内转运，减少对病毒释放的干扰。缺乏LC3C会导致成熟的病毒滞留在细胞内单层膜的囊泡内，影响病毒的释放。这揭示了病毒面对细胞防御措施时往往可以利用自噬逃离免疫，进一步探究自噬途径在病毒免疫中发挥的作用会是展开抗病毒免疫新局面的重要手段。

2 自噬与抗原提呈

抗原提呈是机体从天然固有免疫向适应性免疫转变的过渡阶段，也是机体对病原体进行免疫应答的起始阶段，在此过程中抗原提呈细胞和人类主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex class molecules，MHC)担负起了非常重要的任务。病毒因其寄生的特点，既可以作为外源性抗原，也可以作为内源性抗原，分别激活经典的MHCⅠ或MHCⅡ途径，并且涉及交叉提呈途径，因此了解自噬对抗原提呈的影响对于认识自噬抗病毒作用有重要意义。

启动针对某些病毒的抗病毒免疫可能更多地依赖于被感染的抗原提呈细胞利用内源性抗原通过MHCⅡ途径激活[22]，有实验证明单纯性疱疹病毒1 (Herpes Simplex Virus 1，HSV1)的神经毒性因子ICP34.5(infected cell protein 34.5)可以破坏巨自噬，从而抑制MHCⅡ类分子上的病毒抗原表达[23]。在Goulon等[24]的实验中，基于巨自噬的分子机制，在树突状细胞(dendritic cell，DC)中，利用LC3融合蛋白将HIV抗原特异性地靶向于自噬体，有利于HIV抗原MHCⅡ限制性表达，且增强CD4+T细胞反应。除了直接向溶酶体提供降解的抗原物质，Susana等[25]在实验中发现，在人类抗原提呈细胞中，用Atg8/LC3修饰的吞噬体显示成熟延迟，可以延长抗原呈递时间，吞噬体暂时充当抗原的储存仓库，以维持MHCⅡ类抗原提呈途径的持续活动。

相较于自噬对于MHCⅡ经典途径明确的促进作用，其在MHCⅠ途径中的表现恰恰相反。Monica等[26]明确指出自噬机制支持MHCⅡ限制性抗原提呈，但损害MHCⅠ限制性抗原呈递。他们通过对比Atg5或Atg7缺陷的小鼠与野生小鼠在在MHCⅠ类分子表达方面的表现，发现自噬机制的缺陷会提升其表达，且在体内外对抗病毒感染的实验中Atg5缺陷的DC均能更有效地刺激CD8+T细胞。之后也有实验发现调控自噬启动的重要蛋白Vps34(vacuolar protein sorting 34)缺陷的DC对于卵清蛋白，流感病毒和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒的MHCⅠ类抗原提呈能力均有明显的增强作用[27]。

DC作为专职抗原提呈的免疫细胞，在病毒抗原的交叉提呈中有着重要意义，有研究显示自噬缺陷的DC在交叉提呈可溶性抗原方面(如卵清蛋白)效率下降，但在表面受体靶向抗原或凋亡细胞相关抗原的交叉表达上没有缺陷[28]。然而，也有实验显示缺乏Vps34的DC在与凋亡细胞相关抗原的交叉表达上存在缺陷，而其他抗原表现正常交叉[26]。此外，HSV1的ICP34.5可以对抗感染DC的自噬降解，导致溶酶体降解减少，从而损害对HSV1的抗原处理和MHCⅠ表达，猜测自噬可能是作为一种向免疫系统报告病原体入侵的补偿手段[29]。

实验结果的差异可能归结于所选缺陷自噬基因的不同，或者实验的抗原选取上的不同。此外，有些自噬相关蛋白除了自噬过程以外也参与其他胞内代谢活动。据此推测，当自噬相关蛋白基因缺陷既引起自噬缺陷，也影响到这些胞内代谢活动时，并不能直接说明是自噬缺陷导致了代谢活动的改变。总结来说，自噬在抗原提呈方面的作用可能由于实验的差异而存在一些争议，但实验所得到的结果是确实客观的，利用得到的结论或许可以改进自噬在体外疫苗制备时提纯抗原方面的技术。

3 自噬与淋巴细胞

逃离了固有免疫系统非特异性清除的病毒持续复制，最终会被专职抗原提呈细胞捕获并激活特异性免疫，启动由淋巴细胞主导的体液免疫和细胞免疫。

3.1自噬与T淋巴细胞免疫 通过T淋巴细胞清除异物，尤其是病毒等胞内微生物感染的宿主细胞，是机体应对病毒感染的重要手段。初始T淋巴细胞成熟后分化为功能不同的T细胞，包括细胞毒性T细胞，辅助型T细胞和记忆型T细胞，已经有研究证实自噬对于维护初始T细胞的稳态至关重要[30]，且对于正在发挥免疫功能的T细胞起到保护作用[31]，自噬在各类T细胞中发挥的作用也被重点关注。

效应型T细胞，因其表面主要表达CD8+因子，也称作CD8+T细胞，由其介导的细胞毒性作用对于清除病毒感染细胞尤其重要，有学者通过监测细胞内的自噬通量，观察不同发育阶段中的CD8+T细胞在特异性敲除相关自噬基因后对抗病毒感染的表现[32]，并发现自噬对于正常效应型CD8+T细胞的克隆扩增并不是必需的，但对其通过收缩期形成记忆型T细胞有显著影响，表明有缺陷的自噬通路损害了CD8+T细胞记忆池的形成。同样的结果也出现在Katrin等[10]的实验中，他们发现效应型CD8+T细胞不仅需要自噬来抑制细胞死亡和维持生存以应对病毒感染，且在对抗流感病毒感染的反应中，Atg5缺陷CD8+T细胞达到效应反应峰值的能力下降，在效应阶段无法维持细胞活力，同时也影响了记忆T细胞的存活。

细胞免疫和体液免疫的正常过程都需要辅助型T细胞的参与，其也被称作CD4+T细胞，自噬除了利用清除受损细胞器的功能来保证CD4+T细胞在发育过程中的稳态[33]，还可以帮助其对抗病毒的侵袭。CD4+T细胞是HIV主要的感染细胞，研究表明在HIV病毒攻击后早期自噬选择性地降低了HIV-1转录活化因子(trans-activator of transcription，Tat)，起到了一定的抵抗作用，但很快就被病毒所抑制[34]。

3.2自噬与B淋巴细胞 在体液免疫中，浆细胞产生的抗体可以中和病毒，阻止其结合宿主细胞的受体，如果抗体能在病原体复制之前产生，那么体液免疫就能阻止感染的临床表现，这也是注射疫苗的主要目的。自噬在体液免疫，尤其是在B细胞中发挥的作用已经被研究了相当长的时间。

首先，为了维持B淋巴细胞在淋巴器官中的正常数量，B细胞需要基础水平的自噬[35]。其次，当B细胞接受抗原和辅助型T细胞的双重刺激信号，开始分化为浆细胞以及记忆B细胞时，自噬在其中也起到了重要作用。分化过程中缺乏自噬的B细胞不能够很好活化，且抗体分泌受损，无法形成有效地体液免疫，Kara等[36]和Florent等[37]的实验证实了这一点，且两者都注意到这是由于自噬可能参与了B细胞抗原受体(B cell receptor，BCR)介导的转运，影响B细胞的极化。

对于浆细胞而言，自噬更多地满足了维持细胞稳态和长期体液免疫的双重需要。实验发现自噬缺陷小鼠体内的浆细胞分泌免疫球蛋白的能力明显升高，但与正常小鼠相比，长寿的具有抗原特异性的骨髓浆细胞较少，这证实了免疫球蛋白的合成和生存能力之间具有一种自噬依赖性的保护平衡作用[38]。

在体液免疫中，拥有长寿的记忆B细胞可以更加快速准确的应对病毒的二次感染，有研究表明自噬对于记忆B细胞的初始生成也许不是至关重要的，但是对于它们的长期生存是必需的，在细胞自噬活跃的记忆B细胞维持阶段，刺激自噬可能更有效地改善记忆B细胞的功能[39]。这一发现可能在制备疫苗以及延长疫苗的效应期方面展现了一个新的突破口。

4 结语与展望

自噬从被发现至今，在病毒免疫过程中的多种促进或者抑制作用发现了其在抗病毒治疗和预防方面的巨大潜力。有学者已经想到将抗原同自噬相关蛋白结合直接导向自噬通路，用以提高免疫应答水平；另外自噬可以延长记忆型免疫细胞的存活寿命，相关实验只是发现了这些现象，但具体的机制问题仍未得到解决。除却自噬本身可以维持稳态保证细胞存活以外，与其他细胞活动过程的合作或者拮抗是否也可以提高记忆细胞的寿命？如果解决了这类机制问题，对于提高某些疫苗的长效期方面会是重大的突破。