余甘子对三阴性乳腺癌 MDA-MB-231细胞增殖的影响及分子机制※

马 美，苏占海，王海燕

(青海大学医学院)

乳腺癌中内分泌依赖性乳腺癌、HER2阳性乳腺癌的抗肿瘤药物研究进展顺利，而三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)因其组织学分级高，较其他乳腺癌亚型更具侵袭性而缺乏有效治疗药物。

余甘子为大戟科叶下珠属植物(Phyllanthus emblica L)，主治癌症等，是一味重要的传统藏药[1]，1990年首次载入《中国药典》。既往研究表明，余甘子鞣质类成分柯里拉京对人鼻咽癌细胞KB、卵巢癌细胞A2780、骨肉瘤细胞OS-732、结肠癌细胞HCT-8、人肺腺癌细胞A549等有显著的生长抑制作用[2]。余甘子[3]叶总黄酮对肝癌细胞株Bel-7404、HepG-2，人宫颈癌细胞株Hela，人胃癌细胞株SGC7901，人鼻咽癌细胞株CNE-2，人肺癌细胞株H460，人卵巢癌细胞株A2780等均有良好的生长抑制作用。余甘子提取物对人肺癌细胞A549、肝癌细胞 HepG2 具有抑制作用。余甘子水提物呈剂量依赖性抑制体外培养的L929细胞的生长。

因此，本研究以人乳腺癌MDA-MB-231细胞为体外模型，研究藏药余甘子对MDA-MB-231细胞增殖的影响，并从基因水平探讨其对细胞周期蛋白CyclinG2、细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子p21表达的影响，分析三阴性乳腺癌病人CyclinG2、p21的表达与预后情况，为藏药余甘子的临床应用提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验药物

余甘子的干燥果实(购于安徽亳州中药材交易中心，产地江西，取样量300g，合格证批号191104)。

1.1.2 细胞株

人乳腺癌MDA-MB-231 细胞(来自北京协和医科大学细胞库)。

1.1.3 试剂与仪器

MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(索莱宝，中国)；Trizol、RNAiso Plus、组织/细胞总RNA提取试剂盒和反转录试剂盒(宝日医，中国)；细胞周期与凋亡检测试剂盒(碧云天，中国)。

旋蒸仪(EYELA，日本)、细胞培养箱(Forma，美国)、超净工作台(Thermo，美国)、酶标仪xMark-10483(Bio-rad，日本)、纯水仪(默克密理博，德国)、LightCycler OR 96 全自动荧光定量PCR仪(Roche，瑞士)、低温冷冻离心机(Eppendrof，德国)、琼脂糖凝胶电泳成像仪(Azure biosystem，美国)、CKX4型倒置显微镜(Olympus，日本)、Nanodrop 2000型超微量分光光度计(Thermo，美国)、流式细胞仪(BECKMAN，美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 浸膏制备

取300 g余甘子粉碎，用90%乙醇回流提取3次，每次3 h。将提取液蒸发后得浸膏。

1.2.2 细胞培养及分组

在显微镜下观察细胞贴壁生长情况。当富集度达80%时按 1：2的比例传代，后续实验均采用3代以后贴壁80%的细胞株。分组参照文献[4]分为对照组、实验组。

1.2.3 细胞抑制率检测

将对数期细胞(富集度达80%)铺于96孔板上，每孔加1×105个细胞，每组细胞设置6个平行复孔，置细胞培养箱(37℃，5% CO2)培养24 h，取出培养板，去除上清液。对照组加入100 μL新鲜完全培养基，实验组加入100 μL不等浓度余甘子(320、160、80、40、20μg/mL)，继续培养24 h，再次去除上清液，每孔加入10 μL MTT溶液，培养4 h。然后吸去上清液，每孔加110 μL Formazan溶解液，低速晃动10 min，用酶标仪在 490 nm波长处测光密度(OD)值，根据OD值绘制细胞增殖曲线。实验重复3次。

1.2.4 细胞周期检测

取生长对数期的细胞，消化后吹打成单细胞，均匀铺于6孔板上；待80%细胞贴壁后，换无血清培养基做饥饿处置(24h)；对照组(培养基中含0.1% DMSO)、实验组均设三个复孔；培养时间结束时收集原培养液，用胰酶细胞消化液消化细胞，至细胞变圆后，弃胰酶细胞消化液，终止消化；重悬细胞后再次离心沉淀细胞；加入300 μL预冷的PBS重悬细胞(动作轻柔)，再逐滴缓慢加入700 μL预冷的乙醇中，轻轻吹打混匀，固定24 h(4℃)；离心去除上清液；加入1 mL预冷的PBS重悬细胞，再次离心去除上清液后加入0.5 mL配置好的碘化丙啶染色液，避光水浴(37℃，30min)；上流式细胞仪检测。

1.2.5CyclinG2，p21表达检测

取对数生长期(富集度达80%)的MDA-MB-231细胞，用1×PBS缓冲液洗涤细胞2次，加入1 mL 0.25%胰酶-EDTA消化液，消化3 min左右，加入1 mL完全培养基终止消化，轻柔吹打细胞使其均匀悬浮。按 1×105个细胞/孔的密度，接种于6孔细胞培养板，置CO2培养箱(37℃、5% CO2、1% O2)中培养(过夜)。第2日按照实验分组更换含药培养基：对照组加入200 μL新鲜完全培养基，实验组加入200 μL余甘子药液(c=20μg/mL)，每组设3个复孔，继续常规培养 24 h 后用PBS清洗2次，加入Trizol 裂解，按照总RNA提取试剂盒的操作说明提取各组细胞的总RNA。测定RNA浓度及纯度(A260/280在1.8～2.0之间提示RNA的纯度较高)。同时，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。将纯度较高、完整性良好的RNA反转录为cDNA。按后续的反转录反应需要取出相应所需量的总RNA立即进行反转录，反应条件：37 ℃，15 min×3；85 ℃，5 sec；4 ℃，1 min。设计和合成PCR的引物序列见表1。PCR反应条件：95 ℃，3 min；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s。共 40个循环。每个样品重复3次，反应结束后确认Rtime PCR的扩增曲线和溶解曲线，用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

表1 引物与内参序列

Table 1 Sequence of primers and internal parameters

1.2.6 三阴性乳腺癌患者中CyclinG2和p21的表达与预后分析

利用Kaplan-Meier Plotter数据库分析239例三阴性乳腺癌患者CyclinG2的p21 RNA数据与预后情况。

1.3 统计学方法

所有数据均通过SPSS 22.0和Grapad Prism 7.0统计软件处理，均数之间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 余甘子对乳腺癌细胞株MDA-MB-231增殖的影响

与对照组比较，余甘子组(320、160、80、40、20μg/mL)细胞活性明显降低(P<0.05)，呈浓度依赖效应。依据MTT实验结果，计算余甘子对MDA-MB-231的IC50(26.65μg/mL)，见图1。选取20 μg/mL的余甘子行后续实验。

图1 不同浓度作用后的抑制率(%)图

Figure 1 Inhibition rate detected by MTT after different concentrations(%)

2.2 余甘子对细胞周期的影响

有关研究表明，余甘子鞣质部位能够显著抑制人纤维肉瘤细胞HT1080的迁移和侵袭[4]。陈静等[5]发现余甘子鞣质部位对人肿瘤细胞 A549、BEL-7402的抑制作用机制，可能与诱导肿瘤细胞凋亡及细胞G2/M 期阻滞有关。余甘子使癌细胞发生S期阻滞，影响细胞周期正常进程，与细胞凋亡有关。本实验为了确定余甘子对MDA-MB-231细胞的细胞周期的影响，通过流式细胞术分析了余甘子处理细胞24 h后细胞周期的变化，见图2。

图2 余甘子(20μg/mL)对MDA-MB-231细胞周期的影响图

2.3 余甘子对CyclinG2和p21表达的影响

为了探索余甘子抑制人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞增殖的机制，课题组采用qPCR法检测CyclinG2、p21的表达水平，与对照组(DMSO组)相比，余甘子(20μg/mL)作用后的CyclinG2、p21在 MDA-MB-231 细胞系中表达显著增高(P<0.05)，见图3。

图3 余甘子(20μg/mL)作用后人乳腺细胞内CyclinG2、p21表达水平图

Figure 3 Effects of Yuganzi(20μg/mL)on the expression levels ofCyclinG2 andp21 in mammary gland cells

2.4 对三阴性乳腺癌患者CyclinG2和p21的表达与预后的分析

前述体外试验显示余甘子处理MDA-MB-231细胞后，CyclinG2、p21表达水平显著增高。这两个基因的表达量增高和患者的预后具有相关性，我们通过KMplot分析了239例临床三阴性乳腺癌患者CyclinG2、p21的mRNA数据与预后情况，见图4。高表达CyclinG2基因的患者与低表达的患者相比预后良好，具有显著性差异(P=0.0037)。高表达P21基因的患者与低表达的患者相比预后没有显著性差异(P=0.77)，但从总预后概率曲线图中仍能看出，高表达p21基因的患者预后较低表达者好。

图4CyclinG2、p21基因表达水平与三阴性乳腺癌患者的预后关系图

Figure 4 Relationship betweenCyclinG2 andp21 gene expression level and prognosis of triple negative breast cancer patients

3 讨论

余甘子抗肿瘤作用研究备受关注，关于其提取物及相关成分的抗肿瘤研究较多，从细胞水平的研究较少且结论不同。无限增殖是肿瘤的最大特点，细胞周期紊乱是最直接原因，细胞周期调控是细胞增殖调节的核心环节。文献总结提示：细胞增殖与凋亡的双重假说在肿瘤形成中起主要作用；细胞周期的调控与细胞死亡有关，在肿瘤发生过程中意义重大。目前已确认，细胞周期调控的主要分子基础是周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶复合体的相互作用。凋亡缺陷是促进肿瘤发生、诱导肿瘤治疗失败的主要原因。本研究结果显示，与对照组的MDA-MB-231细胞比较，余甘子作用后的G1/S期细胞比例增加。因此得出，余甘子将细胞周期阻滞在G1/S期，促进了三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的凋亡。

细胞周期蛋白是指与真核细胞的细胞周期呈同步周期性浓度升降的蛋白质，最先是从海胆胚胎中分离出的，为相对分子质量为50 000蛋白质家族的一员。它们与关键的蛋白质激酶(细胞周期蛋白依赖性激酶，CycinG2-dependent kinases，CDKs)结合，并调节它们的酶活性，推动和协调细胞周期。G型蛋白是细胞周期蛋白家族中的新成员，它的结构比较特殊：N端缺少降解所需的“destruction box”氨基酸序列，而C端却包含有与表皮生长因子受体相似的自主磷酸化位点，这表明它既是一种细胞周期蛋白，也是细胞内的信号传导因子。并且CyclinG2的C末端存在一个由46个氨基酸组成的扩展区，其中包括PEST(Prototypic protein destabilizing sequences，原型蛋白不稳定序列)结构域，在CycinG2的第272～294位氨基酸区表现得更为明显，包含一个新近发现的序列结构域N-X-X-Y，它是信号蛋白shcPTB结合的潜在位点。CyclinG2主要在细胞质中，与裂殖酵母的cig2及出芽酵母的clb5具有更高的同源性。它的表达随细胞周期时相不同而发生波动，在S中期达高峰。目前研究均提示它可能作为负调因子参与细胞增殖调节：CyclinG2高表达对HeLa细胞的体外增殖和生长有显著抑制作用[6]。在肾透明细胞中，CyclinG2表达较低，其表达率高可抑制肿瘤的发生。CyclinG2高表达可显著抑制体外培养胃癌细胞SGC-7901的增殖[7]。CyclinG2表达水平的降低和甲状腺乳头状腺癌的恶变关系紧密[8]。在恶性口腔角化细胞和口腔癌上皮细胞中，CyclinG2表达显著下降[9]。本研究中，高表达CyclinG2的人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231在体外增殖活性下降，提示其在胃癌细胞周期调控中发挥负性调节作用，具体影响机制有待进一步探讨。

长链非编码RNA p21是p53最重要的下游基因之一[10]，而p53是参与维持基因组完整性的重要肿瘤抑制基因，所以p21可以和p53共同构成细胞周期G1检查站，即DNA损伤后不经过修复则无法通过，减少了受损DNA的复制和积累，从而发挥抑癌作用[11]。细胞周期素(Cyclin)、细胞周期素依赖性激酶(CDKs)、细胞周期依赖性激酶抑制因子(CDKIs)是参与细胞周期调节的三大元素。其中CDKs促进细胞增殖，而CDKIs抑制细胞增殖。p21是CDKIs家族中的重要成员。负性调节因子p21蛋白缺乏可导致细胞周期正负调节因子失衡，出现细胞周期紊乱[12]，最终导致肿瘤的发生[13]。p21介导的Wnt/β-catenin信号转导通路是肿瘤发生和发展的关键途径：正常肝脏组织p21表达明显高于肝癌组织，p21是p53的一个主要靶点，在检测到DNA损伤时，它与细胞周期阻滞(调节G1期向S期的过渡)有关[14]。胃癌组织p21水平明显降低，低水平p21与胃肿瘤侵袭情况及TNM分期相关[15]。p21在弥漫性大B细胞淋巴瘤组织和细胞系中表达均下调，可用于区分弥漫性大B细胞淋巴瘤和正常组织[16]。SAHA通过调控p21启动子乙酰化水平阻滞细胞周期S期，影响乳腺癌 MCF-7 细胞周期[17]。p21直接抑制细胞周期G1/S期来抑制CDK2、CDK4、CDK6的激酶活性[18]。p21激活激酶 4(PAK4)与乳腺癌的非停泊性生长、存活、转移有关[19]。最近的研究显示辣椒碱干预可明显上调p21表达，抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖[20]。与此一致的是本研究结果显示，余甘子呈浓度依赖性上调p21，提示余甘子抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的分子机制可能与上调p21有关。

综上所述，本研究结果表明，余甘子可抑制MDA-MB-231细胞体外增殖，将细胞周期阻滞在G1/S期，从而促进三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的凋亡，其机制可能与上调CyclinG2和p21 mRNA 水平有关，高表达CyclinG2、p21基因的患者与低表达的患者相比预后较好。

本研究的结论是在细胞水平上得出的，并未结合余甘子干预后的病例资料分析。