hsa-miR-125b-5p在泡型包虫病患者血清中的表达及其信号传导途径和靶基因的筛选※

姜博璠，张耀刚，沙长青，高瑞雪，杨海山，曹得萍

(1.青海大学医学院，西宁 810001；2.青海大学附属医院包虫病重点实验室，西宁 810001；3.桂林医学院基础医学院，桂林 541101)

泡型包虫病几乎100%原发于肝脏，常伴有纤维组织增生和钙化。有研究发现hsa-miR-125b-5p在一些肝脏相关疾病中异常表达[1]，并在活化的肝星状细胞中表现为增加显著[2]。肝星状细胞活化又是肝发生纤维化的主要原因[3]。目前国内外关于泡型包虫病患者血清miRNA差异表达的研究方向不同。本研究试图验证hsa-miR-125b-5p在泡型包虫病患者组与健康对照组血清之间的相对表达量的差异。同时通过生物信息学的方法预测其靶基因可能参与的信号传导途径，为今后泡型包虫病分子标志物的筛选提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血清样本

实验用血清样本均来自青海大学附属医院包虫病样本库。血清在病人未行任何治疗时抽取(排除影响本研究结果的医疗行为)。

1.1.2 引物

实验所使用的引物及内参购于生工生物工程(上海)股份有限公司。引物及内参的序列见表1。

表1 引物及内参基因的序列

Table 1 Sequence of primers and internal reference gene

1.1.3 主要试剂和仪器

总RNA提取试剂盒(RNAiso Plus，Takara，Cat#9108)，反转录试剂盒(MiR-XTM miRNA First-Strand Synthesis Kit，Takara，Code.638313)，荧光定量试剂盒(TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ，Takara，RR820A)；反转录PCR仪(GeneAmp®PCR System 9700，ABI)，实时荧光定量仪器(LightCycler®480Ⅱ，Roche)和超微量核酸蛋白测定仪(NanoDrop 2000c，Thermo)。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取与反转录

每份血清取0.5 mL按照Takara试剂盒说明书步骤提取总RNA。取1 μL总RNA在超微量核酸蛋白测定仪上检测其浓度及纯度，取两次测量的平均值。当A260 nm/A280 nm的比值符合反转录要求时方可进行逆转录实验。反转录依照Takara反转录试剂盒进行操作，按要求配制10 μL反应液[mRQ Buffer(2×)5μL，RNA sample(0.25～8μg)3.75μL，mRQ Enzyme1.25μL]，配置好反应液后按如下反应条件反转录：37 ℃，60 min；85 ℃，5 min。反转所得cDNA加90 μL无酶水稀释后置-20 ℃冰箱。

1.2.2 q-PCR及数据统计分析

1.2.3 hsa-miR-125b-5p基因的生物信息学分析

靶基因筛选所用数据库为starBase(http：//starbase.sysu.edu.cn/index.php)、miRDB(http：//mirdb.org/)、miRwalk(http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)、miRTarBase(http：//miRtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php)数据库。将starBase、miRDB、miRwalk三个数据库所预测的靶基因交集，与miRTarBase数据库提供的已经取得实验验证的靶基因取合集。GO分析和KEGG的信号转导通路分析所用数据库为Enrichr(http：//amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/)、KEGG(https：//www.kegg.jp/)数据库。以P<0.05为标准筛选通路。用STRING数据库预测靶基因所编码的蛋白之间的相互作用，可信度最高的相互作用分数为0.900。可信度依赖考察包括文本挖掘、实验验证等7个方面。

2 结果

2.1 qPCR结果及统计分析

患者组和对照组扩增曲线明显，溶解曲线无双峰。数据见表2。

表2 qPCR数据统计

Table 2 qPCR data

hsa-miR-125b-5p在泡型包虫病患者组血清中的表达量高于健康对照组，具有统计学意义。柱状图见图1。

Control组为健康对照组，Treated组为泡型包虫病患者组

图1 hsa-miR-125b-5p在健康对照组和泡型包虫病患者组中的相对表达量图

Figure 1 Relative expression of hsa-miR-125b-5p in healthy controls and alveolar echinococcosis in patients

2.2 靶基因预测

hsa-miR-125b-5p在starBase、miRDB、miRwalk数据库中预测靶基因数分别为219、925、10 879个。取交集后获得靶基因163个。miRTarBase数据库预测到由实验数据支持的靶基因134个。为保证本实验靶基因预测的准确性，我们将两组靶基因合并，得到靶基因267个(两个集合含有30个相同靶基因)。见图2。

图2 hsa-miR-125b-5p靶基因预测流程图

Figure 2 Flow chart of hsa-miR-125b-5p target gene prediction

2.3 靶基因的GO分析和KEGG通路分析

将所预测的267个靶基因经Enrichr、KEGG数据库进行富集分析和通路分析。富集分析显示三个部分，分别为生物过程部分、分子功能部分和细胞组分部分。具体富集功能见图3。其中对细胞凋亡(在生物过程中的，P<0.05)、MAP激酶激酶活性(在分子功能中的，P<0.05)的调节可能调控了肝脏的细胞凋亡和纤维化，与泡型包虫病患者肝脏病变相符合。通路分析总共分析出228个通路，其中参与调控的靶基因数大于15的通路见表3。在这些通路中，hsa-miR-125b-5p的部分靶基因发挥重要作用。与肝脏纤维病变关联密切的通路有肝细胞癌通路、MAPK信号通路等，见图4、5。

圆圈的大小代表靶基因数目，颜色深浅代表对P值再统计后的q值

图3 GO分析散点图

Figure 3 GO analysis scatter plot

表3 KEGG分析的主要通路及其参与基因

Table 3 Main pathways of KEGG analysis and their participating genes

黄色标记基因为hsa-miR-125b-5p的靶基因

The yellow marker genes are the target genes of hsa-miR-125b-5p

图4 肝细胞癌通路中的TGF-β通路图和MAPK通路图

Figure 4 TGF-β pathway map and MAPK pathway map in hepatocellular carcinoma pathway

黄色标记基因为hsa-miR-125b-5p的靶基因

2.4 靶基因所编码蛋白间的作用

将hsa-miR-125b-5p所预测的靶基因合集分别输入String数据库，构建蛋白之间相互作用网络。网络构建显示共有275个节点和284个边缘，并确定了6个关键基因(degree>20)：TP53、AKT1、EGFR、MAPK14、SMAD4、STAT3，见图6。这些关键基因在蛋白相互作用网中处于主要节点位置，相互之间紧密关联，其在肝细胞的增殖、分化及肿瘤突变中发挥重要作用。

圆圈大小和颜色代表靶基因的可信度，连接线的粗细和颜色代表连接分数

图6 hsa-miR-125b-5p靶基因编码蛋白TP53网络相互作用图

Figure 6 Interaction map of hsa-miR-125b-5p target gene encoding protein TP53 network

3 讨论

研究发现肝脏中的miRNA水平与许多血清中的miRNA水平相关[4]。来自肝脏的miRNA可以通过细胞凋亡和坏死方式被动地进入血清，或通过外泌体和病毒颗粒的分泌积极地进入血清[5]。它们可以作为肝损伤和癌症的生物标志物[6]。

本课题组前期通过基因芯片检测了泡型包虫病患者组与健康对照组血清中miRNA的表达情况。其中表达差异明显的基因主要有hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-377-5p、hsa-miR-937-5p、hsa-miR-4725-3p、hsa-miR-3165等。此外有相似研究指出，泡型包虫病患者肝脏病变组织与边缘带组织存在差异的miRNA有hsa-miR-1237-3p、hsa-miR-33b-3p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-4306等[7]。目前研究表明，血清中hsa-miR-125b-5p的升高与肝脏损害的严重程度有关联，其可能是慢性乙肝合并肝功能衰竭预后不良的预测指标[8]，而泡型包虫病患者肝脏病变以纤维组织增生和钙化为主，对肝脏的损害程度极大。因此本课题组首先选取了基因芯片结果中表达差异明显的hsa-miR-125b-5p做进一步验证及研究。

q-PCR验证得出hsa-miR-125b-5p在泡型包虫病患者血清中呈高表达。GO分析和KEGG通路分析显示，hsa-miR-125b-5p主要调节的靶基因集中在癌症通路及MAPK信号通路中。hsa-miR-125b-5p调节的癌症通路中的重要靶基因Smad4是转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad途径的重要成员之一，该途径参与了肝脏的纤维化[9]。Smad2、Smad3被激活后与Smad4结合形成异源三聚体进入细胞核与DNA结合，调节靶基因的转录，促进肝星状细胞的增殖[10，11]。此外，MAPK通路也是参与肝脏纤维化的重要通路之一。有研究表明[12]，肝纤维化时主要参与的细胞是活化的肝星状细胞，而阻断MAPK通路中的p38可以促进肝星状细胞的增殖，p38可以对肝星状细胞的增殖发挥负性调节作用。应用p38通路抑制剂(SB202190和ML3403)阻断虫体P38信号通路，可以有效抑制体外多房棘球绦虫的存活率，并且对人正常细胞无影响[13]。在hsa-miR-125b-5p的靶基因所调节的蛋白相互作用网络中，主要参与基因有MAPK14、SMAD4、TP53、AKT1、EGFR、STAT3。这些基因在肝脏的病变及细胞的增殖和代谢中发挥着重要作用。比如AKT1在肝细胞癌细胞中异常表达，并且与细胞行为高度相关，包括增殖、存活、新陈代谢和肿瘤发生[14]。研究表明在肝细胞癌中EGFR常常表现为过表达，并发挥关键作用，突出了EGFR在肝脏疾病发展中的重要性[15]。

生物信息学分析结果表明hsa-miR-125b-5p的靶基因及其调控蛋白涉及多种生物学功能，符合泡型包虫病患者肝脏病变尤其是肝脏纤维化的特点。在样本收集时排除患者其他并发症的基础上，本研究所预测的信号通路和重要靶基因与泡型包虫病的发病可能有关联。下一步研究将会在体外肝细胞培养中将hsa-miR-125b-5p过表达，观察其对肝细胞凋亡、细胞周期及细胞活力等方面的影响。

综上所述，本研究发现hsa-miR-125b-5p在泡型包虫病患者组血清中的含量相对于健康对照组是增加的。生物信息学分析结果显示hsa-miR-125b-5p的靶基因调控的肝细胞癌通路及MAPK通路在肝脏纤维化的病变中发挥着重要作用。MAPK14、SMAD4、TP53、AKT1、EGFR、STAT3这6个关键靶基因参与了肝细胞纤维化、增殖及肿瘤病变发展的过程，其中SMAD4、MAPK14所涉及的TGF-β1/Smad信号通路和MAPK信号通路更是直接促进了肝包虫病患者肝纤维化的改变。hsa-miR-125b-5p或许可以作为泡型包虫病生物标志物之一，但具体机制仍需进一步研究与验证。