杞菊汤对PM2.5致急性肺损伤小鼠的预防作用

徐淑琴 杨珺超 刘翠清 陈如程 王真 洪辉华

近年来随着社会经济的不断发展，雾霾天频发，给人类的生活和身心健康造成了严重的影响。近20年的流行病学资料表明，大气污染与呼吸系统疾病的住院人数和死亡率存在着正相关的关系［1］。本实验模拟春秋之季大气污染环境，自拟杞菊汤对PM2.5 致小鼠急性肺损伤进行预防性干预治疗，探讨杞菊汤预防PM2.5 所致小鼠急性肺损伤的疗效，以期为中医药预防此类疾病提供新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF 级健康雄性ICR 小鼠44 只，体重（25±5）g，由浙江中医药大学动物实验研究中心提供。实验时间2019 年9 月至10 月。

1.2 实验药品制备 杞菊汤由枸杞子、杭白菊、马齿苋等组成，药品由浙江省中医院中药房提供，由浙江中医药大学制剂中心制备成含生药0.713g/ml 的中药浓缩药液。将乙酰半胱氨酸制成0.0091g/ml 的乙酰半胱氨酸溶液，药品由浙江省中医院西药房提供。

1.3 实验试剂与仪器 小鼠TNF-α ELISA 试剂盒（70-EK282HS，联科），小鼠IL-1β ELISA 试剂盒（70-EK201BHS，联科），小鼠IL-6 ELISA 试剂盒（70-EK206HS，联科），MDA 试剂盒（A003-1，南京建成），GSH-PX 试剂盒（A005，南京建成），205 暴露仓（山东巨康空气净化科技有限公司定制CAPS-3），TGL-16 型台式高速离心机，5810R 型台式高速冷冻离心机，DKB-454A 型电热恒温水槽（上海森信实验仪器有限公司），DGG-9240A 型电热恒温箱，752型紫外可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司），Bio-Tek ELX800 全自动酶标仪，-80℃低温冰箱（美国Thermo），微量移液器（京君龙实验仪器北京有限公司）。

1.4 动物模型的建立与处理 （1）动物分组：44 只雄性ICR 小鼠随机分成4 组，分别为正常组、模型组、乙酰半胱氨酸组和中药组，每组各11 只。（2）染毒方法：在小鼠染毒造模前1 天对205 暴露仓各项参数进行调试，维持暴露仓中PM2.5 浓度的浓缩倍数为6~10倍，温度波动范围为20~25℃，于造模当日将模型组、乙酰半胱氨酸组和中药组小鼠放入205 暴露仓内，每日持续染毒10~12h，并通过暴露仓中PM2.5 实时检测系统对其浓度进行监测。（3）实验给药和造模：各组小鼠在正常环境下适应性饲养2 周，于实验第1 天起，正常组、模型组小鼠灌服0.9%生理盐水0.01ml/（g·d），乙酰半胱氨酸组和中药组小鼠分别灌服乙酰半胱氨酸溶液和杞菊汤0.01ml/（g·d），连续灌服7d。第8 天起，正常组小鼠放入洁净仓中，连续放入3d，另外三组小鼠放入205 暴露仓中开始染毒，连续染毒3d，10~12h/d。

1.5 观察指标及方法 （1）一般情况：观察小鼠精神和活动状态，毛发光泽度，饮食二便和死亡情况，每日称量并记录小鼠体重；各组小鼠染毒造模期间，每日定时记录暴露仓中PM2.5 的浓度。（2）血清收集：采取摘眼球法收集小鼠外周血，用离心机在4℃、3000r/min 条件下离心10min，取上层血清，置于-80℃冰箱保存备用。（3）指标检测：用ELISA 法检测小鼠血清中TNF-α 的浓度，用生化法检测小鼠血清中丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）的含量，具体操作方法按试剂盒说明书进行。（4）肺组织病理学观察：摘取小鼠右侧肺脏置于福尔马林溶液中浸泡、固定，24h 后石蜡包埋，制作成5μm 厚的切片，脱蜡后，对标本进行苏木素-伊红（HE）染色，最后于光镜下观察小鼠肺组织病理学改变。

1.6 统计学方法 采用SPSS 20.0 统计学软件。计量资料以（±s）表示。多组间均数比较，若方差齐，使用单因素方差分析，两两比较用LSD 法；若方差不齐，使用秩和检验，两两比较用独立样本kruskal-wallis 检验中的成对比较法。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 灌胃期间各组小鼠精神状态良好，活动灵敏，毛发光泽度佳，饮食二便正常，呼吸平稳，体重自然缓慢增长。模型组小鼠放入染毒仓暴露3d 后，精神萎靡，活动减少，毛发光泽度下降，饮食量相对减少，呼吸稍显急促。乙酰半胱氨酸组小鼠放入染毒仓暴露3d 后精神状态一般，活动较正常组小鼠稍有减少，毛发光泽度一般，进食量与正常组小鼠相差不大，呼吸运动较模型组小鼠平稳。中药组小鼠放入染毒仓暴露3d 后精神状态尚可，喜静，毛发略有光泽，饮食量无明显变化，呼吸运动基本正常；实验期间中药组因灌胃操作不当死亡小鼠1 只；小鼠染毒造模期间205 暴露仓中3d 平均PM2.5 浓度分别为209.8μg/m3、140.2μg/m3、225.5μg/m3。

2.2 肺组织病理学改变 正常组小鼠肺组织未见明显病理学变化（见图1）；模型组小鼠肺组织可见肺泡间隔断裂，多个肺泡融合成肺大泡，肺泡腔内可见有淡粉色液体渗出，部分小支气管、肺毛细血管黏膜出现损伤，肺间质、肺泡腔内及支气管周围可见大量的炎性细胞浸润（见图2）；乙酰半胱氨酸组和中药组小鼠可见肺组织炎性改变减轻，部分区域重现完整结构、分布均匀的肺泡，肺泡腔内渗出液相对减少，肺泡间隔有所变薄，部分损伤的支气管、肺毛细血管管壁黏膜有所修复，肺间质、肺泡、支气管及肺毛细血管周围炎性细胞浸润减少（见图3、图4）。

图1 正常组小鼠肺组织

图2 模型组小鼠肺组织

图3 乙酰半胱氨酸小鼠肺组织

图4 中药小鼠肺组织

2.3 各组小鼠血清中TNF-α、MDA、GSH-PX 表达比较 （1）各组小鼠血清中TNF-α 浓度比较：与正常组比较，模型组TNF-α 浓度显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，乙酰半胱氨酸组TNF-α 浓度显著下降，差异有统计学意义（P<0.01），中药组TNF-α 浓度下降，差异有统计学意义（P<0.05）；乙酰半胱氨酸组与中药组TNF-α 浓度差异无统计学意义。（2）各组小鼠血清中MDA 含量比较：与正常组比较，模型组MDA 的含量显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，乙酰半胱氨酸组MDA 的含量显著下降，差异有统计学意义（P<0.01），中药组MDA 含量显著下降，差异有统计学意义（P<0.01）；乙酰半胱氨酸组与中药组MDA 的含量差异无统计学意义。（3）各组小鼠血清中GSH-PX含量比较：与正常组比较，模型组GSH-PX 的含量显著下降，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，乙酰半胱氨酸组GSH-PX 的含量显著升高，差异有统计学意义（P<0.01），中药组GSH-PX 的含量显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；乙酰半胱氨酸组与中药组GSH-PX 的含量差异无统计学意义（见表1）。

表1 各组小鼠血清中TNF-α、MDA、GSH-PX的表达（±s）

表1 各组小鼠血清中TNF-α、MDA、GSH-PX的表达（±s）

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与正常组比较，#P<0.01

组别 只 TNF-α（pg/ml） MDA（nmol/ml） GSH-PX（u）正常组 6 5.70±1.63 3.50±0.74 436.85±23.55模型组 6 9.98±2.16# 6.71±1.31# 338.06±28.01#乙酰半胱氨酸组 6 7.07±1.28** 4.86±1.08** 415.52±36.25**中药组 5 8.15±1.38* 5.16±0.79** 389.53±25.20**

3 讨论

大气污染对人体的慢性毒害不容忽视，西医学对此类疾病的治疗注重防护为主，如雾霾天出门佩戴口罩，居家关闭门窗，在室内摆放绿色植物等，中医学常根据患者的症状、年龄、体质和发病时节的不同，随证治之，相关研究发现大多经典方可缓解PM2.5 对呼吸系统造成的损害，如朱雪等［2］选用煤烟相关颗粒物建立肺损伤小鼠模型，玉屏风散的预防性使用可提高小鼠细胞免疫以及体液免疫功能；师燕飞［3］选用烟熏染毒法建立肺损伤小鼠模型，实验结果显示血府逐瘀汤的干预可改善气道炎症反应和氧自由基代谢紊乱，且可提高细胞免疫功能。许宁等［4］通过气管滴注PM2.5 混悬液法建立肺损伤大鼠模型，实验研究发现连花清瘟可以拮抗大鼠肺部的炎性损伤。本实验采用雾化吸入法对小鼠进行PM2.5 染毒，结果提示PM2.5的急性暴露可引起小鼠急性肺损伤，杞菊汤可通过减轻炎症反应，抑制氧化应激预防PM2.5 对小鼠肺组织造成的损害。

本实验采用205 暴露仓更符合模拟人类在春秋之季遭受自然环境中PM2.5 毒害的过程，本次实验小鼠染毒时长为10~12h，从早上8 点或10 点染毒至晚上8点，也符合人类日常作息规律；雾霾易耗伤人体津液，肺失濡养，可致口鼻咽干、干咳少痰，杞菊汤可润肺生津，利咽止咳；PM2.5 所携带的有毒物质可在肺部日积月累，不易被人体所排泄，且外来之邪可影响人体气血津液的运行，使人出现咳痰，咯血，喘满，胸闷等症，杞菊汤可疏散外邪，清解内毒。现代药理学研究证明杞菊汤中所含的中药均富含大量的维生素和类胡萝卜素［5-8］，国内外研究发现，类胡萝卜素、维生素B、维生素C、维生素D、维生素E 可拮抗PM2.5对人体呼吸系统造成的损伤［9-10］。

本实验仅对炎性细胞因子和氧化/抗氧化系统的标志性物质进行检测，将来可对杞菊汤预防PM2.5 致急性肺损伤的具体作用机制进一步研究。