Src在氧化型低密度脂蛋白诱导平滑肌细胞表型转化中的作用

李森 杨克 王艳萍 李海清 刘震杰 王坚 高志伟 潘以锋 何敏志 陈兵

平滑肌细胞在动脉粥样硬化的发生发展中发挥着重要作用［1］。血管平滑肌细胞受病理刺激时可发生表型变化，即收缩型表型向合成型表型的转变［2］。氧化型低密度脂蛋白（ox LDL）可诱导血管平滑肌细胞发生细胞增殖、迁移及表型转化等病理变化，促进动脉粥样硬化的发生［3］，但ox LDL调控平滑肌细胞的分子机制仍不清楚。本研究拟探讨非受体蛋白酪氨酸激酶（PTK）家族成员Src激酶对ox LDL诱导血管平滑肌细胞表型转化的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

C57BL/6小鼠购自南京大学模式动物研究所，ox LDL 购自英国Serotec公司；Src小干扰RNA（siRNA）购自美国SMARTpoolTM公司；PP2（Src抑制剂）、PP3（PP2的阴性对照）购自美国CalBiochem公司；抗β-肌动蛋白抗体、抗Src抗体（Y-416）抗体、抗Src抗体、抗肌球蛋白重链11（MYH11）抗体及抗CD68抗体购自美国Abcam 公司；细胞培养用培养基及试剂购自美国Gibco公司；总RNA 抽提、cDNA逆转录及Western blot检测试剂盒均购自中国碧云天公司；实时聚合酶链反应（real-time PCR）检测用试剂购自中国天根生物科技有限公司，检测用引物由中国吉玛公司合成。

1.2 原代血管平滑肌细胞培养

清洁级4～6周龄雄性C57BL/6小鼠，体质量20～22 g，断颈处死后暴露胸腔及腹腔，完整分离主动脉，并置于预冷的组织清洗液（生理盐水+1000 IU/mL青霉素+1000μg/mL 链霉素）中，于解剖学显微镜下清洗血污，剥离并去除外膜，保留血管中层。反复清洗2～3次后，将组织移入新的无菌培养皿中，将血管组织快速剪碎成约1 mm2大小的组织块，均匀铺于皿底，于37℃、5%CO2培养箱内放置1 h。缓慢加入原代细胞培养液（F12培养基+20%胎牛血清+100 IU/mL 青霉素+100μg/mL链霉素），放置于培养箱中，每48 h更换新鲜原代细胞培养液。显微镜下定期观察，当达到理想的培养密度后进行分盘培养。

1.3 ox LDL处理血管平滑肌细胞

使用不同浓度的ox LDL（0、12.5、25.0、50.0μg/mL）刺激原代平滑肌细胞48 h后，通过Western blot及real-time PCR 检测平滑肌细胞表型MYH11及CD68的表达。使用50.0μg/mL的ox LDL刺激原代平滑肌细胞不同时间（0、15、30、60 min），使用不同浓度ox LDL（0、12.5、25.0、50.0μg/mL）刺激原代平滑肌细胞1 h后，通过Western blot检测Src蛋白的激活情况。

1.4 Src特异性siRNA转染

使用脂质体试剂（Invitrogen公司）将Src特异性siRNA导入平滑肌细胞内。设Src siRNA组，以100 nm/105个细胞的细胞转染比例将Src特异性siRNA导入平滑肌细胞内；设阴性siRNA 组，在平滑肌细胞中转染无细胞效应的siRNA。使用50μg/mL的ox LDL刺激原代平滑肌细胞48 h。

1.5 Src抑制剂处理血管平滑肌细胞

设Src抑制剂组，使用Src特异性活性抑制剂PP2（10μmol/L）预刺激原代血管平滑肌细胞1 h后，换正常培养基或50.0μg/mL ox LDL刺激48 h。设阴性刺激组，以PP3（10μmol/L）预刺激原代血管平滑肌细胞1 h后，换正常培养基或50.0μg/mL ox LDL刺激48 h。

1.6 Western blot检测

取等量蛋白样品进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），电转移法将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，室温封闭1 h，加入相应一抗，4℃孵育过夜，加入二抗，室温孵育1 h，成像仪曝光记录蛋白条带情况，并采用Image J软件对其进行灰度分析。

1.7 Real-time PCR检测

使用SYBR Green PCR Master Mix反应试剂盒和StepOne系统（Applied BioSystems）对MYH11及CD68的mRNA表达水平进行分析。MYH11上游引物：5′-CGGCAACTCGTGTC CAAC-3′，下游引物：5′-GGTCTTCCATTTC GGCTTT-3′；CD68上游引物：5′-CCCAA GGAACAGAGGAAG-3′，下游引物：5′-GTGGCAGGGTTATGAGTG-3′；β-actin 上游引物：5′-CTGTCCCTGTATGCCTCTG-3′，下游引物：5′-ATGTCACGCACGATTTCC-3′。反应条件：95℃30 s；95℃10 s，65℃31 s，共40个循环。以β-actin为内参，采用StepOne软件v2.1（Applied BioSystems）对结果进行数据分析。

1.8 统计学分析

采用SPSS11.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ox LDL诱导原代平滑肌细胞表型转分化

MYH11为平滑肌细胞表型，CD68为巨噬细胞表型。ox LDL刺激平滑肌细胞后，随着ox LDL刺激浓度的增加，MYH11的mRNA 表达水平呈浓度依赖性降低，CD68的mRNA 表达水平呈浓度依赖性升高（P 均＜0.05）。ox LDL刺激平滑肌细胞后，随着ox LDL刺激浓度的增加，MYH11的蛋白质表达水平呈浓度依赖性降低，而CD68的蛋白表达水平呈浓度依赖性升高（P 均＜0.05）。见表1。

表1 不同浓度oxLDL对平滑肌细胞表型mRNA及蛋白表达水平的影响

2.2 ox LDL促进原代平滑肌细胞中Src激活

为明确ox LDL对于血管平滑肌细胞中Src活化的影响，使用ox LDL刺激平滑肌细胞后检测Src（Y-416）位点磷酸化水平及Src总蛋白表达水平，Src的活性以Src（Y-416）位点磷酸化水平（p-Src）与Src总蛋白表达水平（t-Src）的比值表示。ox LDL刺激平滑肌细胞后，随着ox LDL刺激浓度的增加，Src活性（p-Src/t-Src）呈浓度依赖性与时间依赖性升高（P 均＜0.05）。见表2。

表2 oxLDL对平滑肌细胞中Src激活的影响

2.3 敲减Src表达可抑制ox LDL诱导的原代平滑肌细胞表型转化

为明确Src在ox LDL诱导平滑肌表型转化中的作用，我们通过转染Src siRNA 敲低Src蛋白的表达水平，并观察ox LDL刺激后平滑肌细胞的表型变化。在导入Src siRNA 及阴性siRNA 后，可见Src siRNA 显著抑制Src在平滑肌细胞中的表达（P＜0.05）。而在ox LDL刺激后，阴性siRNA 组可见MYH11的蛋白表达水平显著降低，CD68的蛋白表达水平显著升高（P 均＜0.05）；Src siRNA组MYH11和CD68的蛋白表达水平均未见明显改变。见表3。

2.4 抑制Src蛋白活性可抑制ox LDL诱导的原代平滑肌细胞表型转化

为明确Src激活状态在ox LDL诱导平滑肌表型转化中的作用，我们通过Src特异性抑制剂PP2抑制Src蛋白的激活，并观察ox LDL刺激后平滑肌细胞表型变化。结果显示，Src抑制剂组平滑肌细胞中Src磷酸化水平明显受抑（P＜0.05）。而在ox LDL刺激后，阴性刺激组MYH11的蛋白表达水平明显降低，CD68 的蛋白表达水平明显升高（P 均＜0.05）。见表4。

表3 Src敲低后平滑肌细胞表型蛋白表达水平的影响

表4 Src活性抑制对平滑肌细胞表型蛋白表达水平的影响

3 讨论

在本研究中，我们发现ox LDL可诱导血管平滑肌细胞发生平滑肌表型下调，而巨噬细胞表型上调。ox LDL可促进血管平滑肌细胞中Src激活，抑制Src表达和活性均可减少ox LDL诱导的血管平滑肌细胞表型的变化，提示Src参与ox LDL诱导的血管平滑肌细胞表型转化过程。

Src激酶属于PTK 家族成员，其他PTK 家族成员包括Yes、Fyn、Fgr、Lck、Hck、Blk、Lyn、Frk、Srm、Brk［4-5］。Src是PTK家族最早被发现的成员，结构从氨基端到羧基端分别为豆蔻酰化序列、单一序列、SH3结构域、SH2结构域、激酶结构域和羟基端调节尾端［6］。Src通过磷酸化修饰调控自身活性并向下传递信号。一般情况下，Src527位点酪氨酸处于磷酸化状态，与SH2结构域结合，此时Src呈卷曲状态，将酶活性中心416位点酪氨酸磷酸化位点遮蔽。当Src激酶与细胞膜表面受体结合发生构象改变时，416位点酪氨酸暴露并发生自身磷酸化，同时527位点去磷酸化，使激酶处于激活状态，将细胞外信号向下传递。Src激酶作为受体结合型PTK，缺乏跨膜及胞外段，需与跨膜受体如激素受体、细胞因子及生长因子受体结合以传递细胞外信号，促进细胞增殖、迁移、细胞间黏附及脂质累积［7］。

在动脉粥样硬化中，Src 可结合并激活p47phox，继而激活还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NOX），产生大量O2-，促进内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞参与氧化应激［8］。Src还参与丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）和细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）信号通路的激活，促进细胞炎性反应和增殖迁移［9-10］，从而调控整个内皮-平滑肌-巨噬细胞网络，促进动脉粥样硬化发展。本研究发现ox LDL可以通过提高Src（Y-416）酪氨酸磷酸化水平，促使Src活化，进而诱导平滑肌细胞表型改变，使平滑肌细胞发生表型转化。在抑制Src表达及活化后，平滑肌细胞表型改变被抑制，提示Src的激活参与并调控平滑肌细胞的表型转化。

动脉粥样斑块中平滑肌细胞表型的表达降低和巨噬细胞表型的表达升高，与斑块不稳定明显相关。在动脉粥样硬化斑块进展过程中，平滑肌细胞迁出到内皮下参与斑块区纤维帽的形成，从而稳定斑块［11-12］。因此，平滑肌的表型转化对动脉粥样硬化的发生发展有重要意义。本研究通过体外分离并鉴定原代平滑肌细胞，均检测到ox LDL可使原代平滑肌细胞中平滑肌表型MYH11表达降低，巨噬细胞表型CD68表达升高，表明ox LDL可诱导平滑肌细胞向巨噬细胞表型转化。

探讨动脉粥样硬化过程中ox LDL诱导平滑肌细胞表型转化的分子机制，对研究动脉粥样硬化斑块进展有重要意义。本研究发现Src激活对平滑肌细胞表型的调控作用，有望为动脉粥样硬化的治疗提供潜在靶点。