阿胶强骨口服液连续逆流提取工艺研究

古孜丽阿依·库尔班，黄 卉，陈 伟，朱倩兰，武嘉林,*

(1.新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐830011； 2.新疆华世丹药业股份有限公司，新疆 乌鲁木齐830011； 3.新疆华世丹药物研究有限责任公司，新疆 乌鲁木齐830011)

阿胶强骨口服液是新疆华世丹药业股份有限公司生产的治疗原发性骨质疏松症的复方制剂，由熟地黄、黄芪、党参、枸杞、阿胶、牡蛎等6味药材组成。目前，阿胶强骨口服液采用传统的加热回流提取技术，存在提取时间长、能耗大、溶剂用量大和回收率低等缺点。连续逆流提取技术是使溶剂和药材反方向流动，两者逆流接触，浓度梯度可以始终保持在较高水平，确保连续而充分的接触提取，具有浸出速度快、提取效率高、能耗小等特点[1-4]。作者采用连续逆流提取技术代替传统的加热回流提取工艺，以毛蕊花糖苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷、总多糖含量和提取率为考察指标，采用多指标综合评分法结合正交实验，优化阿胶强骨口服液连续逆流提取工艺。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

黄芪(批号190802，哈巴河)、党参(批号190808，甘肃)、枸杞子(批号190801，精河)、熟地黄(批号190401，河南)、阿胶(批号19030112，山东)、牡蛎(批号1908001，东北)，百草堂公司；阿胶强骨口服液(批号18101402、18100501)，新疆华世丹药业股份有限公司；黄芪甲苷(110781-201717)、毛蕊花糖苷(111530-2017-13)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(111920-201606)、D-无水葡萄糖(110833-201707)，中国食品药品检定研究院。

三氯甲烷，分析纯，天津北联精细化学开发有限公司；正丁醇、硫酸，分析纯，成都科隆化学品有限公司；氨水，分析纯，四川西陇科技有限公司；甲醇、乙腈，色谱级，赛默飞世尔科技有限公司；甲酸，分析纯，天津福晨化学试剂厂；冰乙酸，分析纯，天津永晟精细化工有限公司；苯酚、无水乙醇，分析纯，天津百世化工有限公司。

LC-20AD型高效液相色谱仪、UV-2600型紫外可见分光光度计，日本岛津；蒸发光散射器，天津埃文森；CPA225D型电子分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；Smart-S15UV型超纯水器，上海和泰仪器有限公司；SK3300LHC型超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；连续逆流提取小机，江苏沙家浜医药化工装备股份有限公司；XMTD-7000型电热恒温水浴锅，北京永光明医疗仪器有限公司；GENIUS 4K型台式低速离心机，长沙鑫奥仪器仪表有限公司。

1.2 毛蕊花糖苷含量测定[5-6]

1.2.1 标准溶液的制备

精密称取适量毛蕊花糖苷标准品，加入甲醇溶解，摇匀，制成0.268 mg·mL-1的毛蕊花糖苷标准溶液，冷藏，备用。

1.2.2 供试溶液的制备

精密量取10 mL阿胶强骨口服液置于具塞锥形瓶中，加入20 mL甲醇，超声10 min后，冷却，过滤；滤液经0.22 μm微孔滤膜过滤，即得供试溶液。

1.2.3 色谱条件

Welch Ultimate XB C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.1%醋酸溶液(16∶84，体积比，下同)，流速1.0 mL·min-1，进样量10 μL，柱温30 ℃，检测波长334 nm。

1.3 毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定[7]

1.3.1 标准溶液的制备

精密称取适量毛蕊异黄酮葡萄糖苷标准品，加入甲醇溶解，摇匀，制成0.251 5 mg·mL-1的毛蕊异黄酮葡萄糖苷标准溶液，冷藏，备用。

1.3.2 供试溶液的制备

精密量取5 mL阿胶强骨口服液置于25 mL容量瓶中，加入甲醇，定容至刻度，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜过滤，即得供试溶液。

1.3.3 色谱条件

Welch Ultimate XB C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈(A)-0.2%甲酸溶液(B)，流速1.0 mL·min-1，进样量10 μL，柱温30 ℃，检测波长260 nm。梯度洗脱条件见表1。

表1梯度洗脱条件

Tab.1 Gradient elution conditions

1.4 黄芪甲苷含量测定

1.4.1 标准溶液的制备

精密称取黄芪甲苷标准品12.5 mg置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，充分混匀，制成0.5 mg·mL-1的黄芪甲苷标准溶液。

1.4.2 供试溶液的制备

精密吸取阿胶强骨口服液10 mL置于分液漏斗中，分别用40 mL、30 mL三氯甲烷萃取2次，弃去下层；分别用40 mL、40 mL、30 mL、20 mL水饱和的正丁醇萃取4次，收集合并正丁醇液(上层)；再分别用50 mL、40 mL氨试液洗涤2次，弃去氨水层(下层)；正丁醇液减压回流，浓缩至干，冷却，残渣加甲醇溶解，定容至5 mL容量瓶中，经0.22 μm微孔滤膜过滤，即得供试溶液。

1.4.3 色谱条件

Diamonsil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，蒸发光散射器检测，流动相为乙腈-水(38∶62)，漂移管温度105 ℃，流速3.0 L·min-1，撞击器关闭，理论塔板数按黄芪甲苷计算不低于4 000，进样量10 μL。

1.5 总多糖含量测定[8-12]

1.5.1 标准溶液的制备

精密称取10 mg D-无水葡萄糖标准品置于100 mL容量瓶中，加水溶解，并定容至刻度，摇匀，即得0.1 mg·mL-1的D-无水葡萄糖标准溶液，冷藏，备用。

1.5.2 供试溶液的制备

精密吸取阿胶强骨口服液1 mL置于10 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。精密量取0.5 mL，加无水乙醇9.5 mL，4 000 r·min-1离心15 min，倾去上清液，加纯化水溶解沉淀，并定容至25 mL容量瓶中，即得供试溶液。

1.5.3 5%苯酚溶液的配制

精密称取苯酚固体5.0 g，加水溶解，定容至100 mL棕色容量瓶中，摇匀，即得5%苯酚溶液。

1.5.4 测定方法

精密吸取供试溶液2.0 mL，精密加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀；迅速加入硫酸5.0 mL，摇匀，静置10 min；40 ℃水浴锅中保温15 min，取出，迅速置于冷水中冷却至室温，以相应的试剂为空白，在波长490 nm处测定吸光度。

1.6 连续逆流提取工艺正交实验优化[13-15]

在前期预实验以及原工艺的基础上，以料液比(g∶mL，下同)、乙醇体积分数、提取时间及提取温度为考察因素，以毛蕊花糖苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷、总多糖含量和提取率为评价指标，进行L9(34)正交实验，设定其加权平均数均0.2，采用综合加权评分法，优化阿胶强骨口服液连续逆流提取工艺。正交实验的因素与水平见表2。

表 2正交实验的因素与水平

Tab.2 Factors and levels of orthogonal experiments

2 结果与讨论

2.1 毛蕊花糖苷含量测定方法学考察

2.1.1 高效液相色谱图

取毛蕊花糖苷标准溶液及供试溶液按1.2.3色谱条件进样，结果见图1。

图1 毛蕊花糖苷标准溶液(a)及供试溶液(b)的高效液相色谱图Fig.1 HPLC spectra of verbascoside standard solution(a) and test solution(b)

2.1.2 线性关系

分别取268 μg·mL-1、134 μg·mL-1、67 μg·mL-1、33.5 μg·mL-1、16.75 μg·mL-1、8.375 μg·mL-1的毛蕊花糖苷标准溶液，按1.2.3色谱条件进样，测定峰面积，以毛蕊花糖苷浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)绘制标准曲线，拟合得线性方程为：y=13088x+6196.3(R=0.9995)。表明毛蕊花糖苷浓度在8.375～268 μg·mL-1范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.1.3 精密度

精密吸取134 μg·mL-1毛蕊花糖苷标准溶液，按1.2.3色谱条件连续进样6次，测定峰面积。结果显示，毛蕊花糖苷峰面积的RSD为0.24%，表明仪器精密度良好。

2.1.4 重复性

取阿胶强骨口服液(18101402)6份，按1.2.2方法制备供试溶液，按1.2.3色谱条件进样，测定峰面积。结果显示，毛蕊花糖苷峰面积的RSD为1.47%，表明该方法重复性好。

2.1.5 稳定性

取阿胶强骨口服液(18101402)，按1.2.2方法制备供试溶液，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h按1.2.3色谱条件进样，测定峰面积。结果显示，毛蕊花糖苷峰面积的RSD为1.63%，表明供试溶液在12 h内稳定。

2.1.6 加标回收率

取已知含量的阿胶强骨口服液(18101402)6份，加入一定量的毛蕊花糖苷标准溶液，按1.2.2方法制备供试溶液，按1.2.3色谱条件进样，测定峰面积，计算加标回收率。结果显示，平均加标回收率为105.17%，RSD为1.11%。

2.2 毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定方法学考察

2.2.1 高效液相色谱图

取毛蕊异黄酮葡萄糖苷标准溶液及供试溶液按1.3.3色谱条件进样，结果见图2。

图2 毛蕊异黄酮葡萄糖苷标准溶液(a)及供试溶液(b)的高效液相色谱图Fig.2 HPLC spectra of calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside standard solution(a) and test solution(b)

2.2.2 线性关系

分别取125.75 μg·mL-1、62.88 μg·mL-1、31.44 μg·mL-1、15.72 μg·mL-1、7.86 μg·mL-1、3.93 μg·mL-1的毛蕊异黄酮葡萄糖苷标准溶液，按1.3.3色谱条件进样，测定峰面积，以毛蕊异黄酮葡萄糖苷浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)绘制标准曲线，拟合得线性方程y=45232x+18634(R=0.9996)。表明毛蕊异黄酮葡萄糖苷浓度在3.93～125.75 μg·mL-1范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.2.3 精密度

精密吸取50.3 μg·mL-1的毛蕊异黄酮葡萄糖苷标准溶液，按1.3.3色谱条件连续进样6次，测定峰面积。结果显示，毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积的RSD为0.55%，表明仪器精密度良好。

2.2.4 重复性

取阿胶强骨口服液(18100501)6份，按1.3.2方法制备供试溶液，按1.3.3色谱条件进样,测定峰面积。结果显示，毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积的RSD为1.43%，表明该方法重复性好。

2.2.5 稳定性

取阿胶强骨口服液(18100501)，按1.3.2方法制备供试溶液，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h按1.3.3色谱条件进样，测定峰面积。结果显示，毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积的RSD为1.92%，表明供试溶液在12 h内稳定。

2.2.6 加标回收率

取阿胶强骨口服液(18100501)6份，每份加入一定量的毛蕊异黄酮葡萄糖苷标准溶液，按1.3.2方法制备供试溶液，按1.3.3色谱条件进样测定，计算加标回收率。结果显示，平均加标回收率为96.23%，RSD为2.9%。

2.3 正交实验结果

取4 000支阿胶强骨口服液处方量的熟地黄、党参、黄芪、枸杞、阿胶、牡蛎，置于连续逆流提取设备中提取，收集提取液，减压回收乙醇，浓缩至一定比重的浸膏，其余步骤按原工艺进行配制口服液。正交实验结果与分析见表3，方差分析见表4。

以综合评分为考察指标，采用极差直观分析4个因素对提取效果的影响大小依次为D>C>B>A；方差分析结果显示，D因素有极显著性差异，C因素有显著性差异。结合直观分析，确定连续逆流最佳提取工艺为A1B1C2D3，即料液比1∶6、乙醇体积分数40%、提取时间120 min、提取温度80 ℃。

表 3 正交实验结果与分析

Tab.3 Results and analysis of orthogonal experiments

表 4方差分析

Tab.4 Variance analysis

注：F0.05(2，2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00。

2.4 提取工艺验证

称取处方量的各个药材，按最佳提取条件进行3次验证实验，测得毛蕊花糖苷含量分别为25.75 μg、22.24 μg、28.05 μg；毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量分别为87.9 μg、70.84 μg、92.21 μg；黄芪甲苷含量分别为111.34 μg、94.58μg、121.26 μg；总多糖含量分别为15.41 mg、13.35 mg、17.93 mg。表明该提取工艺稳定可靠。

2.5 讨论

阿胶强骨口服液(国药准字Z2000039)是由新疆华世丹药业股份有限公司研发的治疗原发性骨质疏松症及小儿佝偻病的一款经典中药制剂，其以独特的作用机理和显著的临床疗效广受患者青睐。作者所在课题组拟对阿胶强骨口服液进行创新再评价研究。将从药物生产工艺、药材质量标准(杂皮胶源阿胶质量监控)等方面对阿胶强骨口服液进行再评价研究，以期对该口服液进行守正创新，获得一款疗效确切、质量可靠、技术工艺先进的新型阿胶强骨口服液。

根据新颁中医药法中药再评价是作为打破传统中药品种多、小、散、乱、全格局的必要途径。目前我国中药品种9 000多种，批号近6万个，生产厂家近4 000家，行业集中度低，低水平重复，产品缺少深入研发。改变这种格局需要设计严谨、实施严格、结果可信的上市后的药物再评价研究，需要经得起考验的再评价循证证据。相比于传统的加热回流提取方式，新型连续逆流提取显著改善了阿胶强骨口服液提取效率及提取溶剂的回收率，提取工艺和质量标准的改善是我国中药做强做大的主攻方向。

本研究新增4种质控指标作为阿胶强骨口服液新型连续逆流提取工艺的监控指标，不仅对产品的生产和药效具有指导作用，还给我国已上市产品再评价给出了参考。

3 结论

以毛蕊花糖苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷、总多糖含量和提取率为考察指标，采用多指标综合评分法结合正交实验，优化阿胶强骨口服液连续逆流提取工艺。结果表明，4个因素对提取效果的影响大小依次为：提取温度>提取时间>乙醇体积分数>料液比，确定最佳提取工艺为：料液比1∶6(g∶mL)、乙醇体积分数40%、提取时间120 min、提取温度80 ℃。