一种复合益生菌对凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染能力的影响*

2020-06-09 11:31杨运楷宋晓玲王海亮谢国驷

渔业科学进展 2020年3期

杨运楷宋晓玲王海亮谢国驷黄倢

杨运楷1,2宋晓玲2①王海亮2谢国驷2黄倢2

(1. 上海海洋大学上海 201306；2. 中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室农业农村部海水养殖病害防治重点实验室青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室青岛 266071)

本研究选择1株地衣芽孢杆菌() BL-9、1株枯草芽孢杆菌() BS-12、1株金丽假交替单胞菌() CDM8，以1∶1∶1将其组成复合益生菌，各益生菌水体添加浓度为107CFU/ml，进行为期30 d的凡纳滨对虾()养殖实验。实验分为暂养期(7 d)、益生菌处理期(15 d)、副溶血弧菌()攻毒期(10 d)。结果显示，养殖水体中添加复合益生菌能显著增加水体和对虾肠道可培养细菌总数(<0.05)，攻毒实验结束时，实验组对虾累积存活率为(73.33±6.83)%，显著高于阳性对照组(25.33±15.43)%。对虾抗病基因热激蛋白70 (Heat shock proteins 70,)、β-1,3-葡聚糖结合蛋白-脂蛋白(Beta-1,3-glucan-binding protein-lipoprotein,)、脂多糖-β-1,3-葡聚糖结合蛋白(Lipopolysaccharide-β-1, 3-glucan binding protein,)、抗菌肽在益生菌处理阶段均出现不同程度的上调，在攻毒阶段虽呈现各自不同的表达情况，但所有基因都经历了更大幅度上调。研究表明，水体中添加芽孢杆菌和假交替单胞菌组成的复合益生菌可提高凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染能力，对虾抗病力的提高可能与益生菌增加对虾肠道可培养细菌数量、抗病相关基因表达水平及过氧化氢酶(CAT)活性有关。

凡纳滨对虾；复合益生菌；副溶血弧菌；免疫基因；过氧化氢酶

致急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)是近5年来严重危害全球对虾养殖业发展的疫病之一，该病是由携带基因的弧菌引起的一类细菌性疾病。目前，已报道的致AHPND弧菌包括副溶血弧菌()、坎贝氏弧菌()、欧文氏弧菌()等(贾丹等, 2018)。本研究所用副溶血弧菌为本实验室在2013年从广西患AHPND的凡纳滨对虾()中分离出1株致病性副溶血弧菌(AHPND-causing,AHPND)，编号为20130629002S01。该菌对卤虫无节幼体的半致死浓度(LD50)为2.58×105CFU/ml(王娜等, 2016; 陈蒙蒙等, 2018)。

益生菌是指在一定浓度范围内能够提高机体健康的活性微生物制剂，作为抗生素及化学药剂的替代品，在医学、食品、养殖等领域已经得到了快速的发展(Balcázar, 2006)。益生菌在水产养殖过程中的作用机理有以下几个方面：一是通过细菌自身代谢分解食物或产生消化酶提高机体消化能力；二是竞争性抑制，通过竞争营养、附着位点或合成、分泌抗菌活性因子等来抑制有害微生物的繁殖；三是通过降低水体中的氨氮等有害物质改善养殖水环境；四是通过增强机体免疫功能来提高抗病能力等(Thompson, 1999; Balcázar, 2006)。高戈等(2017)使用巨大芽孢杆菌()进行凡纳滨对虾生物絮团养殖实验，养殖结束时，添加巨大芽孢杆菌组的对虾体长、体重均显著高于其他2组。张盛静等(2015)研究发现，在饲料中添加单一益生菌或复合益生菌均可显著提高对虾抗副溶血弧菌感染的能力，且复合益生菌的保护效果更佳。

芽孢杆菌在水产养殖中的应用较为广泛。刘观斌等(2015)在养殖水体中泼洒适当浓度的枯草芽孢杆菌()可以改善水质，提高罗非鱼机体的免疫力、抗氧化能力，进而提高罗非鱼抗无乳链球菌()病的能力。张欢欢等(2016)研究发现，生物絮团对虾养殖系统中添加菌株02，能改善菌群结构，抑制弧菌生长。作者在前期的研究工作发现，在凡纳滨对虾养殖水体中单独添加107CFU/ml数量级的地衣芽孢杆菌()BL-9、枯草芽孢杆菌BS-12菌液后，使用副溶血弧菌进行攻毒，实验组相对于对照组均显著提高对虾的成活率。金丽假交替单胞菌()CDM8具有突出的弧菌拮抗能力(Wang, 2018)，在零交换水条件下，能显著提高凡纳滨对虾ZⅢ幼体和仔虾PL5的变态率和成活率(孙博超等, 2019)。因此，本研究选择上述3株菌组成复合益生菌添加到养殖水体中，评价其对养殖水体及凡纳滨对虾肠道菌群、抗副溶血弧菌感染能力、过氧化氢酶(CAT)活性、抗病基因表达水平的影响，以期为复合益生菌在凡纳滨对虾养殖中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 对虾与益生菌

1.1.1 实验用凡纳滨对虾实验用凡纳滨对虾购自山东莱州单山水产养殖公司(体长为6.2~10.6 cm)。实验前参照OIE(2017)水生动物疾病诊断手册及Wang等(2018)中的PCR方法，进行AHPND病原的套式PCR检测，结果为阴性。投喂饲料为宁波天邦饲料有限公司生产的凡纳滨对虾全熟化颗粒饲料，对虾养殖容器为100 L的PC塑料桶，养殖有效水体为60 L的过滤海水。

1.1.2 实验用菌种及培养实验用菌株：金丽假交替单胞菌CDM8、地衣芽孢杆菌BL-9、枯草芽孢杆菌S-12、副溶血弧菌20130629002S01，均由本实验室分离、鉴定及保存。

菌液发酵采用2216E培养基，28℃恒温震荡培养，当菌液的OD580 nm≈1时(此时，细菌浓度约为2×109~3×109CFU/ml)，终止发酵，使用时通过稀释的方法调整细菌的水体添加浓度。

CDM8、BL-9、BS-12和副溶血弧菌在水体的添加浓度分别为2.24×107、2.93×107、2.77×107和2.13× 105CFU/ml。

1.2 实验期及实验分组

实验分3个时期：暂养期、益生菌处理期、副溶血弧菌感染期。

暂养期：对虾不分组，共7 d。期间随机挑选 12尾凡纳滨对虾进行病原检测，暂养第7天检测养殖水体及对虾肠道可培养细菌数量，采集对虾肝胰腺组织用于抗病基因表达及CAT酶活性检测。暂养稳定后，挑选630尾大小均匀、活力良好的对虾用于后续实验。

益生菌处理期：对虾分为实验组和对照组。每组7个平行，其中，3个用于统计死亡率，4个用于采样(对照组为2组，预先设置攻毒阶段的阴性和阳性对照组)。实验组养殖水体中添加复合益生菌，各菌以1∶1∶1比例添加，对照组不添加益生菌。实验周期为15 d，由于CDM8拮抗能力较强，所以益生菌添加采取交替添加的方式，即3 d为1个添加周期。第1天添加益生菌CDM8菌液，第2天添加BL-9和BS-12菌液，共5个添加周期。在益生菌处理期，第7天和第14天检测养殖水体及对虾肠道可培养细菌数量，采集对虾肝胰腺组织用于抗病基因表达及酶活性检测。

副溶血弧菌攻毒期：对虾分为3组，实验组、阳性对照组和阴性对照组，每组7个平行，其中，3个用于统计死亡率，4个用于采样。益生菌处理期，每桶包含对虾30尾，攻毒期调整为每桶25尾。实验组和阳性对照组使用副溶血弧菌浸浴攻毒，先将对虾于2.13×107CFU/ml副溶血弧菌菌液中浸泡15 min，然后放回，向养殖水体中添加副溶血弧菌菌液使得水体中的弧菌浓度达到2.13×105CFU/ml左右，阴性对照组使用无菌2216E培养基浸浴。副溶血弧菌攻毒期持续10 d，攻毒期间不添加益生菌。在攻毒的6、18、42、66、90 h采集对虾的肝胰腺组织进行实验相关指标的测量，并统计每天对虾的累积死亡率。

1.3 实验管理

实验期间连续充气，水温控制在(28±1)℃。根据每天对虾桶内是否有残饵来调整投喂量，每天投喂 2次。48 h换水1次，换水量为水体积的2/3。

1.4 样品及处理

1.4.1 水体和对虾肠道内可培养细菌计数水体及对虾肠道细菌计数采用2216E琼脂平板涂布计数的方式。对虾肠道活菌计数，先将对虾完整肠道加入无菌PBS缓冲液研磨，后进行活菌计数。

1.4.2 对虾肝胰腺样品采集及处理在各个取样时间点采集对虾肝胰腺，每桶取对虾2尾，每组3个平行，共6尾对虾。解剖采集的对虾肝胰腺经液氮迅速冷冻后，放置在–80℃超低温冰箱保存。

1.5 RNA提取及cDNA合成

按TRIZOL Reagent (Invitrogen)说明书进行总RNA的抽提，用Nanodrop 2000c (Thermo)测定RNA浓度，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量后，保存于–80℃备用。cDNA合成采用TaKaRa公司生产的反转录试剂盒进行，使用方式参考试剂盒说明书。

1.6 实时荧光定量PCR

1.6.1 实时荧光定量PCR及引物使用Fast Essential DNA Green Master荧光定量试剂盒(Roche, 瑞士)进行实时荧光定量PCR检测，方法参考试剂盒说明书。抗病相关基因的检测引物名称及序列见表1。

1.6.2 荧光定量体系及反应程序 PCR反应体系包括SYBR Premix ExTM(2×) 12.5 µl，cDNA模板1 µl，上下游引物各0.5 µl (10 µmol/L)，DEPC处理水10.5 µl。PCR反应条件：94℃，5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环。每个组织的样品设3个重复。对实验结果采用2‒DDCt法进行相对定量分析(Livak, 2001)。

1.7 免疫酶活性检测

对各组凡纳滨对虾肝胰腺组织进行CAT酶活测定，测定方法参照检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书进行。

1.8 数据分析与处理

采用SPSS 16.0软件对实验数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，以Duncan’s多重比较进行不同处理间的显著性分析，<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 益生菌处理期养殖水体及对虾肠道可培养细菌数量

养殖水体可培养细菌数量见图1A，在添加益生菌前(0 d)，各组水体可培养细菌数量处于105CFU/ml数量级(>0.05)。益生菌处理阶段第7天和第14天实验组水体可培养细菌数量均处于107CFU/ml数量级，显著高于对照组(<0.05)。对虾肠道可培养细菌数量见图1B，在添加益生菌前(0 d)凡纳滨对虾肠道细菌总数在104CFU 数量级，添加益生菌后实验组对虾肠道内可培养细菌数量第7天(3.22×104CFU)，第14天(3.54×104CFU)均显著高于对照组(第7天为3.04× 104CFU, 第14天为3.03×104CFU) (<0.05)。

2.2 副溶血弧菌攻毒后各组对虾累积存活率

副溶血弧菌攻毒后取实验组和阳性对照组濒死对虾肝胰腺组织，用TCBS平板涂布培养，长出大量绿色菌落，与攻毒所用副溶血弧菌菌落形态相同。实验组和阳性对照组的对虾均在第18小时开始出现死亡。攻毒后258 h时，实验组和阴性对照组对虾的累积存活率分别为73.33%和86.67%，而阳性对照组对虾的累积存活率为25.33%。实验组比阳性对照组累积存活率提高了48.00% (表2)。

表1 实时荧光定量PCR所用的引物及序列

Tab.1 Primer sequences used in quantitive real-time PCR

图1 养殖水体(A)及对虾肠道(B)可培养细菌总数

不同字母代表同一时间点不同组之间存在显著差异，“*”代表同一组之间不同时间点存在显著差异。下同

Different letters in the same time mean significantly different at 0.05 level (<0.05), “*” means significantly different at 0.05 level in the same group (<0.05). The same as below

2.3 对虾肝胰腺组织免疫基因相对表达量

2.3.1基因的相对表达量益生菌处理期，凡纳滨对虾肝胰腺的相对表达量测定结果见图2A。第7天和第14天实验组基因表达量显著高于对照组(<0.05)。攻毒期，凡纳滨对虾肝胰腺的相对表达量测定结果见图2B。实验组和阳性对照组表达均呈现上升后下降的趋势，均在18 h达到最大值(<0.05)。

2.3.2基因的相对表达量益生菌处理期，凡纳滨对虾肝胰腺的相对表达量测定结果见图3A，第7天和第14天实验组基因表达量均显著高于对照组(<0.05)。攻毒期，凡纳滨对虾肝胰腺的相对表达量测定结果见图3B，实验组对虾的的表达量呈先升高后下降趋势，而阳性对照组呈先升高再下降，再升高再下降的趋势；实验组和阳性对照组基因的表达量分别在6和66 h达到最高(<0.05)。

2.3.3基因的相对表达量益生菌处理期，凡纳滨对虾肝胰腺的相对表达量测定结果见图4A。实验组基因表达量在第7天和第14天均显著高于对照组(<0.05)。攻毒期，凡纳滨对虾肝胰腺的相对表达量测定结果见图4B。实验组和阳性对照组基因的表达均呈先升高后下降的趋势，实验组基因表达量在42 h达到最大值，阳性对照组中基因在18 h基因达到最大值。

2.3.4基因的相对表达量益生菌处理期，凡纳滨对虾肝胰腺的相对表达量测定结果见图5A，实验组表达量在第7天显著高于对照组，而在第14天时表达量则低于对照组的(<0.05)。攻毒期，凡纳滨对虾肝胰腺的相对表达量测定结果见图5B，实验组和阳性对照组基因的表达量均呈先升高后下降的趋势，攻毒42 h以后，实验组对虾的表达量高于阳性对照组(<0.05)。

表2 凡纳滨对虾感染副溶血弧菌后累积存活率

Tab.2 Accumulative survival rate of L. vannamei post V. parahaemolyticus challenge (%; n=3; ±SD)

注：同列中数据后面不同字母表示显著性差异(<0.05)

Note: Different letters in the same column mean significantly different (<0.05)