低温驯化下斑马鱼LINE1的表达检测*

陶筱帆 谢婷婷 李小霞 罗军涛 白雅静,2 韩兵社,2,3 张俊芳,2,3

低温驯化下斑马鱼的表达检测*

陶筱帆1谢婷婷1李小霞1罗军涛1白雅静1,2韩兵社1,2,3张俊芳1,2,3①

(1. 上海海洋大学 水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室 上海 201306；2. 上海海洋大学 水产科学国家级实验教学示范中心 上海 201306；3. 上海海洋大学 中国科学技术部海洋生物科学国际联合研究中心 上海 201306)

长散布核元件-1(Long spread nuclear element-1,)是跳跃基因。前期比较基因组研究发现，南极鱼经历漫长的低温适应进化后，与南极圈外的同亚目鱼类相比较，在基因水平上的扩增效率高达8~300倍，但的扩增与鱼类抵御寒冷之间的关系尚未明了。本实验对斑马鱼()胚胎成纤维细胞ZF4进行了不同时间梯度的低温处理(18℃、5 d和18℃、30 d)，同时对斑马鱼成鱼也进行了不同时间的低温处理(10℃, 3 h、6 h、1 d、3 d、5 d)。采用RT-qPCR检测了的mRNA水平，并克隆了斑马鱼基因启动子区，利用Luciferase双荧光报告系统，在ZF4细胞中验证5¢UTR在低温压力下的生物活性。结果显示，短时间低温处理下，ZF4细胞中mRNA水平有所降低，而在长时间低温处理中，的mRNA水平显著升高。在成鱼中，短时间低温处理下，mRNA水平降低；长期低温处理下，mRNA水平显著升高。在ZF4细胞中发现，5¢UTR具有生物活性。在低温处理(18℃，3 d)下，报告基因信号减弱，间接表明启动子活性减弱。研究结果表明，低温压力会影响在鱼类中的表达。本研究为进一步探究在鱼类适应低温环境中的作用机制奠定了基础。

；低温；斑马鱼；ZF4细胞；启动子

真核生物基因组中存在大量的转座子元件，包含、和。迄今为止，3种逆转座子依旧具有活性：、和元素。逆转座子包含5¢UTR、2个开放阅读框及具有PolyA尾的3¢UTR (Dombroski, 1991)。属跳跃基因，占人类基因组约17%，为自主转座，通过RNA中间体自我传播；而和为非自主转座(Lander, 2001)。它们利用“复制–粘贴”机制，通过RNA中间体在整个基因组中繁殖，这一过程称为逆转录(Lu, 2016)。逆转座子的转座导致基因组改变，多数时候给基因组带来负面影响，如：改变基因组结构、影响基因表达、改变基因调控方式等(Gilbert, 2005; Tubio, 2014)。因此，宿主基因会通过启动子区域甲基化或者小RNA干扰等机制来抑制转座(Kinomoto, 2007; Levin, 2011)。但研究表明，转座元件与基因组是互益的(Faulkner, 2009)，逆转座子的转座可导致新基因产生，这对于物种多样性和物种进化具有积极意义(Hamon, 2011; Volff, 2000)。

鱼类作为变温动物，水温变化在很大程度上影响其生理及行为(Perry, 2005)。南极大陆经历了漫长降温，水温常年处于0℃以下(Gordon, 2003)，南极圈内与南极圈外同亚目鱼类相比较逆转座子的扩增倍率在8倍以上，有些甚至高达300倍(Chen, 2008)。这些基因可能参与了鱼类适应寒冷的过程，在漫长的历史进化中变化。同时，研究发现，在面对环境压力时，逆转座子的逆转座活性会受到环境因素影响(Butelli, 2012)。因此，推测寒冷可能会导致鱼类逆转座子扩增，并且可能与鱼类适应寒冷环境相关。

斑马鱼()体型纤细，成体长为3~4 cm，对水质要求不高。孵出后约4个月达到性成熟，成熟鱼每隔几天可产卵一次，卵子体外受精，体外发育，胚胎发育速度快，胚体透明、子代多、遗传背景清楚，容易进行实验操作，易于在实验室内繁殖饲养，与人类基因87%相似(Watanabe, 2016)，作为一种模式生物应用于生物学中(Howe, 2013; Sollars,2003)。斑马鱼ZF4细胞来自孵化后1 d的斑马鱼胚胎(Driever, 1993)，被广泛用于生物学实验中(Hu, 2015)。为研究低温对的影响，本研究检测了斑马鱼ZF4细胞18℃培养5 d和30 d、10℃培养3 h、6 h、1 d、3 d、5 dmRNA水平以及通过报告基因监测基因5¢UTR在18℃ 3 d的活性变化，为研究寒冷环境下鱼类基因组中的表达变化奠定基础。

1 材料与方法

1.1 ZF4细胞和斑马鱼

斑马鱼胚胎成纤维细胞ZF4购买于ATCC (American Type Culture Collection)。斑马鱼由实验室斑马鱼鱼房饲养，恒温循环水系统，水温为27℃~ 28℃，pH为6.8~7.8，用丰年虫()饲养。

1.2 主要试剂和仪器

胎牛血清和胰蛋白酶、DMEM︰F12液体培养基购于Gibco公司；T4连接酶和限制性内切酶购于NewEngland；SYBR Green购于罗氏公司；Lipofectamine3000购于英潍捷基贸易有限公司；RT-qPCR反转录试剂盒购于宝生物工程(大连)有限公司；双荧光报告系统试剂盒购于Promega公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。

表1 PCR扩增引物

主要仪器：细胞低温培养箱(Galaxy170R, eppendorf)、LightCycler 480Ⅱ(罗氏)；酶标仪(Bio-Rad公司)；NanoDrop2000赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.3 实时荧光定量PCR

应用IDT引物设计软件(http://sg.idtdna.com/ sessionTimeout.aspx)设计RT-qPCR引物(,, 表1)。采用Trizol方法提取斑马鱼细胞和肌肉组织的RNA，使用TaKaRa反转录试剂盒(货号: RR047A)进行反转录实验，以反转录的cDNA为模板，进行SYBR Green荧光定量PCR实验。PCR条件：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环；72℃延伸5 min。每个样品3个生物学重复，相对表达量的计算方法用2–ΔΔCt计算，β-actin作为内参。

1.4 载体构建及报告基因检测

提取斑马鱼细胞基因组DNA，以基因组DNA为模板，上下游引物(，, 表1)分别引入酶切位点Ⅰ和Ⅰ，利用PCR扩增基因5¢UTR，Ⅰ、Ⅰ酶切后用T4连接酶连接至载体PGL4.10中，将重组质粒转化到大肠杆菌内。

选择生长状态良好的ZF4细胞接种于6孔板中，次日细胞完全贴壁后弃除培养基，按Lipofectamine3000说明书进行转染。

采用Dual-Luciferase Reporter Assay System进行双荧光报告基因活性检测，按说明书进行测定。

1.5 统计分析方法

统计学分析应用GraphPad Prism 5 (GraphPad software, 美国)软件分析。的表达数据和双荧光检测数据均来自3次独立重复实验，采用Student’s-test方法分析统计学差异，<0.05表示具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 斑马鱼胚胎成纤维细胞(ZF4)和斑马鱼成鱼在低温处理下LINE1的表达变化

有研究表明，长期生活在低温环境的南极鱼基因组与南极圈外同亚目鱼类的基因组相比较，转座家族发生了8~300倍的扩增(Chen, 2008)。本研究选取的2个基因和进行实时荧光定量PCR。在斑马鱼成鱼中，10℃为斑马鱼低温生存的临界温度，因此，选取10℃作为鱼类低温处理温度。与在常温(28℃)饲养的成鱼相比，在10℃低温处理3 h和6 h的成鱼肌肉组织中的mRNA水平(图1A)有所下调，而在10℃低温处理1 d、3 d、5 d的成鱼肌肉组织中mRNA水平显著上调，在成鱼中的mRNA水平(图1B)与的mRNA有相同趋势；在ZF4细胞中，选取18℃作为低温环境(Han, 2016)，与常温(28℃)细胞对比，在18℃低温处理5 d的细胞中的mRNA水平有所下调，而在18℃低温处理30 d的细胞的mRNA水平显著上调(图1C)。

2.2 重组质粒构建与检测

实验室前期研究发现，低温环境会引起CpG位点甲基化的改变(Han, 2016)。猜测低温环境会影响5¢UTR区域启动子的活性，以斑马鱼基因组DNA为模板，将2个基因的5¢UTR区域进行PCR扩增(图2)。

图1 斑马鱼低温处理下LINE1表达的变化(*: P<0.05.下同)

图2 PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果

1:-promoter; 2:-promoter

载体PGL4.10-basic与PCR扩增片段经过Ⅰ和Ⅰ双酶切后，在T4 DNA连接酶的作用下，将PCR扩增产物插入PGL4.10-basic载体中(图3)，将重组质粒送上海生工生物工程有限公司测序，测序结果与PCR扩增的基因序列相同，重组质粒构建成功。

2.3 双荧光报告系统检测结果

通过检测相对荧光素酶活性，间接检测5¢UTR区域启动子活性，5¢UTR区域启动子活性越高，荧光素酶活性发光值越高。海肾荧光素作为检测系统内参，当5¢UTR区域启动子没有生物学活性时，不能检测到荧光素酶活性发光值。将构建的重组质粒转染进常温(28℃)培养ZF4细胞中，结果显示，与阴性对照PGL4.10-basic相比，重组质粒均能检测到荧光素酶活性发光值，而PGL4.10-basic不能检测到荧光素酶发光值，表明5¢UTR具有启动子活性(图4A)。将重组质粒与PGL4.10-basic和PGL3- promoter转染到18℃低温处理3 d的ZF4细胞中，PGL4.10-basic为阴性对照，PGL3-promoter为阳性对照，结果显示，与常温(28℃)细胞相比，重组质粒在低温处理下荧光素酶活性发光值均有不同程度的下降，表明短期低温处理会影响基因5¢UTR区域启动子活性(图4B)。

图3 PGL4.10-LINE1 5¢UTR质粒构建

图4 重组质粒PGL4.10-LINE1-promoter转染斑马鱼细胞后双荧光素酶相对活性分析

3 讨论

属于最丰富的一类自主转座因子。尽管多数被抑制活性，但依旧有很少一部分的具有活性，的插入虽与疾病相关，但同样影响基因组的进化(Beck, 2011)。当面对环境因素刺激时，基因组进行自身进化诱导转座子转座(McClintock, 1984)，使生物对环境变化做出适应性改变。在之前研究中发现，南极圈内物种与南极圈外物种转座子扩增效率存在巨大差异。在西西里血橙中，寒冷诱导逆转座子的扩增(Butelli, 2012)。这提示的扩增可能与生物体对长期寒冷环境的适应相关。为了研究逆转座子在长期低温环境下的大量扩增是否与生物体对寒冷环境的适应相关，将ZF4细胞培养在18℃5 d，发现ZF4细胞生长明显停滞，而后20 d左右逐渐恢复生长状态，尽管相比28℃依旧缓慢。本研究发现，短期低温处理诱导斑马鱼成鱼及斑马鱼ZF4细胞的mRNA水平下调，长期低温处理诱导斑马鱼成鱼及斑马鱼ZF4细胞的mRNA水平显著上调，推测对生物体适应外界低温环境压力可能有积极作用。生物体在寒冷环境下转座子转座水平升高，可能增加生物体基因型的多样性，使其对环境压力产生适应性进化。

在自然界中遵循着优胜劣汰的法则，从生物的进化开始，生物体内有益于适应环境、使生物体更好生存下去的基因会保留，垃圾基因会逐渐被淘汰，那么在长期寒冷环境中，L1的显著扩增是否是生物体为了适应寒冷环境而选择的一种生物途径？在之前研究中发现，启动子甲基化水平在低温环境下有所改变：18℃低温处理ZF4细胞5 d，启动子甲基化水平升高，而低温处理30 d时，甲基化水平降低(Han, 2016)。生物体会通过甲基化水平来调节表达水平，与甲基化水平呈负相关关系(Hata,1997)，因此，甲基化水平升高时，被抑制，mRNA水平呈下降趋势；当甲基化水平降低时，激活，mRNA水平呈上升趋势。据此推测，低温环境会通过影响5¢UTR区域启动子活性，进而影响的扩增。构建重组质粒发现，低温确实能引起5¢UTR区域启动子活性改变，推测这种调节可能是生物体应对外界低温环境压力的方式之一，L1对生物体适应外界低温环境压力可能有积极作用。生物体在寒冷环境下转座子转座水平升高，可能增加生物体基因型的多样性，使其对环境压力产生适应性进化。

总之，本研究通过对斑马鱼细胞以及斑马鱼成鱼不同时间的低温处理，研究的表达变化，为更好了解在鱼类寒冷适应中的作用机制奠定了基础。

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Expression of) During Cold Acclimation

TAO Xiaofan1, XIE Tingting1, LI Xiaoxia1, LUO Juntao1, BAI Yajing1,2, HAN Bingshe1,2,3, ZHANG Junfang1,2,3①

(1. Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Ministry of Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 3. International Research Center for Marine Biosciences, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306)

The long-spread nuclear element-1 () retrotransposon is a mobile element in genome. Previous comparative genomic studies found that Antarctic Notothenioid fish underwent a long low-temperature adaptation evolution, and compared with Notothenioid fish outside the Antarctic circle,genes were duplicated by 8~300 fold.The link between this augmentation and the resistance of fish to cold is not known. In this study, zebrafish () embryonic fibroblasts ZF4 were exposed to a low temperature (18℃) for 5 days and 30 days, and adult zebrafish were exposed to a low temperature (10℃) for 3 h, 6 h, 1 d, 3 d, and 5 d. The mRNA expression ofwas examined using RT-qPCR. The promoter regions of zebrafishgene were cloned and the biological activity of5'UTR at low temperature were verified in ZF4 cells by using the dual-luciferase reporter system. The following results were obtained: (1) In ZF4 cells,mRNA expression was decreased by short-term low temperature treatment, but was significantly increased by long-term low temperature treatment. (2) In adult fish,mRNA expression was decreased by short-term low temperature treatment, but was significantly increased in long-term low temperature treatment. (3) The5'UTR was found to be biologically active in ZF4 cells. (4) It was found that during low temperature treatment (18℃, 3 d), the reporter gene signal was weakened, which indirectly indicated that thepromoter activity was weakened. The results showed that low temperature stress affectedexpression in fish, which presents a foundation for further study on the mechanism of action of

; Low temperature;; ZF4 cells; Promoter

Q74

A

2095-9869(2020)03-0088-06

10.19663/j.issn2095-9869.20190226001

张俊芳，教授，E-mail: jfzhang@shou.edu.cn

2019-02-26,

2019-03-14

* 国家自然科学基金项目(31372516; 81770165)、上海市教育委员会“东方学者”计划和上海市人才发展资金项目(201457)共同资助 [This work was supported by National Natural Science Foundation of China (31372516; 81770165), and Project of Shanghai Education Commission “Oriental Scholars” Program, and Shanghai Talent Development Fund Project (201457)]. 陶筱帆，E-mail: 512099587@qq.com

http://www.yykxjz.cn/

陶筱帆, 谢婷婷, 李小霞, 罗军涛, 白雅静, 韩兵社, 张俊芳. 低温驯化下斑马鱼的表达检测. 渔业科学进展, 2020, 41(3): 88–93

Tao XF, Xie TT, Li XX, Luo JT, Bai YJ, Han BS, Zhang JF. Expression ofin zebrafish () during cold acclimation. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(3): 88–93

ZHANG Junfang, E-mail: jfzhang@shou.edu.cn

(编辑 冯小花)