日粮纤维水平对苏淮猪直肠中氮、磷含量及结肠菌群数量的影响

王欢，杨密，蒲广，范丽娟，高琛，牛培培，吴承武，周娟，黄瑞华,4，李平华,4,5*

(1. 南京农业大学养猪研究所,江苏 南京 210095；2. 南京农业大学淮安研究院, 江苏 淮安 223001；3. 淮安市淮阴种猪场, 江苏 淮安 223322；4. 江苏省现代农业(生猪)产业技术体系集成创新中心，江苏 南京 210095；5. 淮安市南农大新农村发展研究有限公司，江苏 淮安 223001)

近年来，随着养猪业集约化的发展，养殖过程中会产生大量粪便，生产者往往追求动物最好的生产性能，但低效的饲料消化导致过量的营养素排放到环境中，由此产生的氮、磷及有害微生物对生态环境造成了严重的负面影响，已经制约了养猪业的可持续发展[1]。减少猪氮、磷以及有害微生物的过量排放，缓解对生态环境的压力是养猪业正在关注的热点[2]。研究表明日粮调控措施可以减少猪的氮、磷及有害微生物的排放，为解决畜禽污染问题提供了解决方案，主要包括降低日粮粗蛋白水平、提高日粮纤维(dietary fiber，DF)水平及使用日粮添加剂等[3-4]。Poulsen等[5]研究发现在菜籽粕、葵花籽粕、蚕豆及三者混合物中添加麦麸进行发酵增加了蛋白质和磷消化率，从而减少了猪和家禽的氮、磷排放；朱丽媛[6]指出随着日粮纤维水平的增加，粪便氮排放量显著降低。与此同时，许多研究表明，日粮纤维有利于有益细菌的增殖，抑制有害细菌的增殖。Laitat等[7]研究发现，饲粮补充24%的甜菜渣能够显著降低生长猪肠道大肠杆菌丰度。Kumar等[8]在感染沙门菌小鼠的饮食中加入10%和20%的米糠可显著降低粪便中沙门菌脱落，增加乳酸杆菌丰度。畜牧业饲料原料资源短缺、人畜争粮矛盾等日益凸显，纤维性饲料原料因资源丰富、成本低廉等特点引起关注，在生猪生产及相关研究中的应用均呈增加态势[9]。粗纤维的生理功能及在降低猪粪便中氮、磷含量以及肠道有害微生物上的潜在作用逐渐受到重视。

为了一定程度缓解养猪业环保及人畜争粮压力，选择具有耐粗饲特性的苏淮猪，以资源丰富、成本低廉的脱脂米糠为纤维源设计试验。米糠是糙米精制过程产生的副产物，占水稻总重量的10%左右，包括种皮、果皮、糊粉层和胚乳层等[10]。通过溶剂萃取法从米糠中去除脂肪，可以生产脂肪浓度为2%至4%的脱脂米糠。在前期本课题组研究中，蒲广等[11]用不同脱脂米糠替代水平的日粮饲喂苏淮育肥猪发现，28%脱脂米糠替代水平的日粮仍不影响苏淮猪育肥猪的生长性能。因此在不影响苏淮猪生长性能的前提下，本试验研究对照组，14%和28%脱脂米糠替代玉米的日粮对苏淮猪直肠氮、磷及结肠总菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌、乳酸杆菌和双歧杆菌丰度的影响，旨在从环保角度寻求脱脂米糠的适宜添加水平，为减少猪养殖粪便污染的研究提供一定理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验选择体重相近(62.90±0.78)kg、健康的苏淮阉公猪15头，随机分为3个处理组，每组5个重复，因使用奥饲本全自动生产性能测定系统进行饲喂，每个重复1头猪，自由采食和饮水。试验预试期10 d，所有猪饲喂基础日粮；正试期28 d，对照组和试验Ⅰ～Ⅱ组分别饲喂以基础日粮，14%和28%脱脂米糠替代玉米日粮。中性洗涤纤维水平分别为8.89%、12.93%和17.94%。

1.2 试验日粮

本试验基础日粮依照《猪饲养标准(NY/T 65-2004)60～90 kg肉脂型生长肥育猪标准》进行配置。该饲料由江苏省淮安市正昌饲料有限公司生产。试验组日粮设置14%、28%脱脂米糠替代玉米的梯度，旨在从环保角度寻求脱脂米糠的适宜添加水平，为减少苏淮猪粪便污染的研究提供一定参考。因此，除纤维含量不同外，其余营养成分基本一致或相近，具体日粮组成及营养水平见表1。

表1 日粮配方及营养水平(干物质基础)

项目 组别 对照组试验Ⅰ组试验Ⅱ组原料组成/%玉米 68.6155.0041.00麸皮 15.4016.1517.21米糠粕 0.0014.0028.0046%豆粕 13.310.407.50豆油 0.001.833.7498.5%赖氨酸0.030.030.03盐 0.300.300.30石粉0.820.850.85磷酸氢钙0.750.650.5860%胆碱0.040.040.04预混料1)0.400.400.40营养水平2)消化能/(MJ·kg-1) 13.1313.1313.13粗蛋白/%15.616.1316.40中性洗涤纤维/%8.8912.9317.94酸性洗涤纤维/%5.536.538.13钙/%0.550.550.55有效磷/%0.270.270.27赖氨酸/%0.650.650.65蛋氨酸+胱氨酸/% 0.450.460.47

注：1)预混料为每千克日粮提供：维生素A 8 000 U，维生素D31 500 U，维生素E 100 mg，维生素K34 mg，维生素B12 mg，维生素B28 mg，维生素B63 mg，维生素B120.04 mg，烟酸30 mg，泛酸35 mg，叶酸0.6 mg，生物素0.13 mg，胆碱150 mg，铁60 mg，铜5 mg，锌60 mg，锰10 mg，硒0.15 mg和碘0.1 mg。

2)粗蛋白、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维为测定值，其他营养水平为计算值。

1.3 饲养管理

整个试验期间，所有猪全天自由采食，自由饮水。猪舍内通过安装空气源热泵保障舍内环境的一致性，试验期内猪舍温度保持在15.5～19.6 ℃。所有试验猪按常规免疫程序注射疫苗。试验在南京农业大学淮安研究院试验猪场进行。

1.4 样品采集、指标测定

1.4.1 样品采集

28 d所有猪电击宰杀后，快速打开腹腔，分离出肠道。无菌操作，结肠中点处刮取黏膜于2 mL灭菌冻存管，迅速保存于液氮中，以用于微生物丰度的测定。采集直肠末端内容物，按每200 g样品加15 mL的10%硫酸均匀混合于自封袋中，并且排尽空气，保存在-20 ℃冰箱待测。

1.4.2 直肠内容物氮、磷含量测定

将直肠食糜样品置于烘箱65℃温度下烘干，氮、磷含量测定均以食糜干重为基础。氮含量采用K1160全自动凯氏定氮仪(Hanon，中国)测定。磷含量采用钼黄法进行测定，破坏样品中的有机物，使磷游离出来，在酸性溶液中用钒钼酸铵处理，再在波长420 nm下用分光光度计进行比色测定。

1.4.3 结肠微生物16S rRNA基因拷贝数量(丰度)测定

使用FastDNA®Spin Kit试剂盒(MP Biomedicals,美国)提取新鲜黏膜样品微生物总DNA，表2是引物序列，由北京擎科新业生物技术有限公司合成。构建标准质粒制作特定的标准曲线，利用纯化试剂盒(OMEGA)对目标细菌的PCR反应产物进行纯化，克隆到通用载体(TsingKe，中国)中。重组质粒细菌经过14 h扩培后，挑选阳性克隆菌液测序，对细菌基因序列比对分析(NCBI)，对比结果成功后含氨苄的LB液体培养基扩培14～16 h。用AxyPrepTMPlasmid Miniprep Kit (AXYGEN)提取重组质粒DNA，成功构建目标细菌的标准质粒。利用 ABI 7300 Real-time PCR 仪对细菌进行定量PCR，并制作标准曲线。细菌的拷贝数计算公式如下：

拷贝数=(6.023 3×1023×C)/(660×109×A),其中C：DNA浓度(ng/μL)，A：目的片段长度(bp)。

表2 定量PCR引物

引物序列(5'→3') 参考文献总菌F:ACTCCTACGGGAGGCAGCAG[12]R:ATTACCGCGGCTGCTGG大肠杆菌F:CATGCCGCGTGTATGAAGAA[13]R:CGGGTAACGTCAATGAG-CAAA产气荚膜梭菌F:CGCATAACGTTGAAAGATGG[14]R:CCTTGGTAGGCCGTTACCC乳酸杆菌F:GCAGCAGTAGGGAATCTTCCA[13]R:GCATTYCACCGCTACACATG双歧杆菌F:CGGGTGAGTAATGCGTGACC[15]R:TGATAGGACGCGACCCCA

1.5 数据分析

试验结果用Excel进行初步处理后，利用SPSS 20.0软件对各指标进行单因素方差分析(One-way ANOVA)。数据以“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 日粮纤维水平对苏淮猪直肠内容物氮、磷含量的影响

由表3可见，在第28天，苏淮猪直肠中氮的含量试验Ⅰ组显著(P<0.05)、试验Ⅱ组极显著(P<0.01)低于对照组；试验Ⅰ组和试验Ⅱ组苏淮猪直肠中磷的含量与对照组没有显著差异(P>0.05)。

表3 日粮纤维水平对直肠内容物中氮、磷含量的影响10-2mg·g-1

项目对照组试验Ⅰ组试验Ⅱ组氮含量3.25±0.12Aa2.95±0.17ABb2.77±0.12Bb磷含量1.92±0.092.01±0.122.22±0.11

注：不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，同行数据肩标相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下同

2.2 日粮纤维水平对苏淮猪结肠总菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌、乳酸杆菌和双歧杆菌丰度的影响

由表4可见，在第28天，与对照组相比，试验Ⅰ组、试验Ⅱ组苏淮猪结肠总菌、大肠杆菌、乳酸杆菌和双歧杆菌丰度差异不显著(P>0.05)。试验Ⅰ组产气荚膜梭菌丰度显著低于对照组(P<0.05)。

表4 日粮纤维水平对总菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌、乳酸杆菌和双歧杆菌丰度的影响

项目对照组试验Ⅰ组试验Ⅱ组总菌8.33±0.098.08±0.187.76±0.17大肠杆菌5.75±0.165.60±0.435.13±0.41产气荚膜梭菌4.06±0.17a2.98±0.21b3.63±0.30ab乳酸杆菌6.97±0.156.51±0.266.31±0.26双歧杆菌5.01±0.085.00±0.195.08±0.16

注：肠道细菌丰度以每克样品拷贝数的lg对数计算。

3 讨论

3.1 日粮纤维水平对苏淮猪直肠内容物氮、磷含量的影响

研究表明，氮和磷对于猪来说是重要的元素，但在饲料中过量地添加氮磷会造成猪粪便中氮、磷元素的过量排放而破坏生态环境[1]。因此，利用营养调控措施(降低粗蛋白水平、提高日粮纤维水平及使用日粮添加剂等)来降低猪过量排泄氮磷带来的环境污染，对保护生态环境具有重要的意义。目前，日粮纤维对减少猪的排泄污染的研究已成为一个新的研究热点。Patráš等[16]研究发现，饲料中添加纤维可以减少猪舍粪便氮的排放。本试验发现，第28天试验Ⅰ组和试验Ⅱ组直肠氮含量均显著低于对照组。推测一方面可能是脱脂米糠源的氨基酸组成和比例更有利于苏淮猪对氮元素的吸收利用，另一方面可能是日粮纤维促进了苏淮猪对氮的利用，但其促进机制有待深入研究。本研究结果说明了在蛋白能量满足苏淮猪蛋白能量需求时，增加日粮中脱脂米糠替代水平可以减少氮的排泄量从而缓解猪粪氮排放过量带来的生态环境污染等问题。

磷是动物体必需的矿物质，对机体有重要的生理和代谢功能。但是，猪的胃肠道内缺少降解植酸磷的酶而无法充分利用植物饲料中的植酸磷，因此猪对磷的利用率极低[17]。为了满足动物生长需要，在实际生产中经常人为在饲料中添加磷元素，但因磷过量添加导致粪磷含量高对生态环境造成污染。因此，如何充分提高植酸磷的利用率，降低粪便中磷的过量排泄、减少环境污染成为重大问题。前人研究表明，日粮纤维有利于提高磷消化率降低猪粪磷排放。Poulsen等[5]研究发现在菜籽粕、葵花籽粕、蚕豆及三者混合物中添加麦麸进行发酵减少了猪和家禽的氮、磷排放。Li等[9]发现提高日粮纤维素添加水平显著降低生长猪内源性磷的粪便排泄率。本试验结果发现，脱脂米糠替代水平的升高并没有引起直肠磷排泄的增加，推测可能是因为脱脂米糠的有效磷含量比较高，苏淮猪对高脱脂米糠日粮的吸收效果较好。日粮纤维水平如何影响猪对磷的吸收机制有待进一步研究。本试验结果表明，28%的脱脂米糠替代玉米的日粮对苏淮猪直肠内容物磷含量没有影响，提示合理的脱脂米糠替代能够满足苏淮猪对磷的需求，一定程度避免了粪磷污染。

3.2 日粮纤维水平对苏淮猪结肠总菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌、乳酸杆菌和双歧杆菌丰度的影响

肠道菌群对肠道健康非常重要，不仅因为肠道菌群的不平衡可能导致炎症反应，而且可能与宿主争夺营养[18]。乳酸杆菌和双歧杆菌是哺乳动物肠道中的主要益生菌，它们通过多种机制对肠道病原体起到抑制作用。营养干预引起的大肠杆菌减少被认为在一定程度上对机体有益。由于畜禽粪便的随意堆放，猪粪便中病原微生物如大肠杆菌(致病性)等致病细菌导致畜禽传染病的蔓延与发展。致病微生物的大量繁殖，不仅污染各类农作物，而且经由灌溉或饮用水水源，最终对人和其他动物造成感染。因此降低猪粪便中有害微生物对保护我们的生存环境，特别是水资源的保护有重要意义。许多研究表明，日粮纤维有利于有益细菌的增殖，抑制有害细菌的增殖。张叶秋等[19]研究发现饲喂苏淮猪34.8%的米糠高纤维日粮，在试验第28天，高米糠日粮组乳酸杆菌、双歧杆菌丰度与对照组相比均显著增加。Yan等[20]研究发现，随着纤维水平的增加，仔猪肠道大肠杆菌含量并没有显著变化，本试验中结果与之基本一致，本试验结果表明在不影响苏淮猪生长性能的前提下，14%脱脂米糠的替代水平有效降低有害菌产气荚膜梭菌的丰度，28%脱脂米糠的替代不会引起结肠大肠杆菌、产气荚膜梭菌等有害菌的增加，脱脂米糠替代水平较为合理。

4 结论

从环保角度看，14%日粮脱脂米糠替代水平较好，能显著降低结肠黏膜产气荚膜梭菌丰度，极显著降低直肠氮排放量，且对苏淮育肥猪直肠磷排放量和结肠黏膜总菌、大肠杆菌、乳酸杆菌和双歧杆菌丰度没有显著影响。