算盘子提取物治疗大肠杆菌性腹膜炎的机制研究

胡明烨 王长娜 武春晓 周程艳 余颖聪

大肠杆菌性腹膜炎是最常见的细菌性腹膜炎(bacterial peritonitis，BP)，是由肠道菌群紊乱位移造成的腹腔急性、感染性炎症，出现腹腔感染后，肠袢及大网膜通过粘连局限炎症的蔓延，如未能及时控制感染则进一步发展形成弥漫性炎症，引发全身炎症反应综合征，进而导致多脏器衰竭。在其感染过程中大量激活的炎性细胞释放多种内源性介质，包括促炎细胞因子，其中主要包括TNF-α、IL-1β、IFN-γ等，进而引发或加重肠道屏障的破坏并发生炎性反应，并导致肝脏、肾脏等重要脏器结构及功能的损害。

算盘子为大戟科植物，具有驱风、利湿、消肿散瘀、抗炎镇痛等药用功效；对痢疾、皮炎、泄泻、急性胃肠炎等有很好的治疗效果，早在《江西民间草药》中便有算盘子抗菌治疗肠炎的记录。药理研究发现，该属植物有抗菌消炎、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒等作用[1]。本研究根据大肠杆菌性腹膜炎的诱发机制及算盘子的成分、功效、药理作用，对算盘子进行抑菌、抗炎实验，旨在观察算盘子对大肠杆菌腹膜炎的治疗效果并探索其作用机制，为临床应用提供相关的依据。

材料与方法

1.实验动物与菌株：SPF级昆明种小鼠50只，雌雄各半，4～6周龄，体质量20±2g，由北京维通利华生物技术有限公司提供，动物生产许可证号为SCXK(京)2016-0002。大肠杆菌bio-00021(批号44102-3a15)、金黄色葡萄球菌bio-00002(批号26001-26)均购自北京百欧博伟生物技术有限公司。

2.试剂、材料与仪器：SOD试剂盒、MDA试剂盒、GSH试剂盒(批号20160929)均购自南京建成生物工程研究所，IFN-γ ELISA试剂盒、IL-1β ELISA试剂盒、TNF-α ELISA试剂盒(批号均为20180104)购自江苏酶标生物科技有限公司，CRP、MMP9、NF-κB抗体(批号均为20170428)购自北京博奥森生物技术有限公司，算盘子采自广西壮族自治区梧州市藤县天平镇新陶村自然晾干后保存，Microm HM 325 scientific型手动轮转式石蜡切片机购自美国Thermo Fisher Scientific公司，Synergy HT型全自动酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司。

3.算盘子提取物制备：取算盘子叶粉末加入蒸馏水圆底烧瓶回流2h，连续2次，合并2次提取液，向提取液中依次加入石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，将4次萃取液及萃取后水相旋转蒸发至恒重，备用。

4.纸片扩散法测抑菌活性：将不同极性溶剂提取得到的恒重物配置成浓度分别为0.0170、0.0150、0.0150、0.0156、0.0147g/ml的溶液。取各溶液15μl于6mm的圆滤纸片上并烘干，后将浸过不同样品的滤纸片分别放置在涂有大肠杆菌和金黄色葡萄球菌培养基上，37℃培养16h后用直尺测量抑菌圈直径，以确定样品抑菌活性[2]。

5.倍比稀释法测定最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)：液体倍比稀释法测定MIC，用蒸馏水将不同提取物配置成浓度均为0.0150g/ml的溶液。取96孔板倍比稀释后取15μl各稀释度的样品溶液于长有金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的培养皿上37℃培养16h。以能够抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生长的最小药物浓度为该样品的MIC值。

6.实验分组、造模与给药：将50只小鼠随机分成正常组、模型组、小檗碱阳性组(0.0774g/ml)、乙酸乙酯提取物高、低剂量组(0.1548、0.0774g/ml)，每组10只。阳性组、高、低剂量组按照1ml/100g的药量灌胃给药，每日2次，连续5天，其余组按比例灌0.9%NaCl注射液。除正常组外其余各组小鼠均注射1ml浓度为1.5×106CFU/ml的大肠杆菌，每日1次，连续两天。实验结束后取血清于-80℃贮存备用；同时将肝脏、肾脏、小肠组织保存于10%甲醛溶液中备用。

7.血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β及MDA、SOD、GSH含量检测：取上述血清，具体按照ELISA试剂盒和酶联试剂盒说明书，用酶标仪检测血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β炎性因子的含量及MDA、SOD、GSH的含量。

8.组织形态学观察：取上述肝脏、肾组织、小肠组织经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋、切片、脱蜡、HE染色、封片，在100倍光镜下观察各组织的病理形态学变化。

9.小肠组织中NF-κB、MMP-9、CRP蛋白表达水平的检测：运用免疫组化SP法进行检测。将上述切片烤片、脱蜡、修复抗原，分别滴加NF-κB、MMP-9、CRP一抗(1∶200)，孵育、显色，苏木精复染，脱水透明，封片。用Image Pro Plus 6.0软件测定镜下阳性染色部位的累积吸光度(A)，以表示蛋白表达水平。

结 果

1.滤纸片法测抑菌活性：培养16h后通过直接观察菌落生长及测量抑菌圈直径(图1、表1)可知，算盘子提取物对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌有抑制效果，但不同极性萃取物的抑菌效果有明显差距。其对大肠杆菌抑菌效果依次为乙酸乙酯层、正丁醇层、二氯甲烷层，石油醚层和蒸馏水层无明显抑菌效果；对金黄色葡萄球菌效果依次为乙酸乙酯层、正丁醇层、二氯甲烷层、蒸馏水层，石油醚层无明显抑菌效果。

图1 提取液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果A.石油醚层;B.二氯甲烷层;C.乙酸乙酯层;D.正丁醇层;E.蒸馏水层

表1 不同萃取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径

2.倍比稀释法测定MIC：96孔细胞培养板倍比稀释测得MIC值，乙酸乙酯层、正丁醇层、二氯甲烷层对金黄色葡萄球菌的MIC分别为1.88、7.50、15.00mg/ml;对大肠杆菌的MIC分别为1.88、7.50、15.00mg/ml,详见表2。

表2 金黄色葡萄球菌和大肠杆菌最低抑菌浓度

浓度1代表药液的原始浓度(乙酸乙酯为0.015g/ml、正丁醇为0.015g/ml、二氯甲烷为0.015g/ml)，其余浓度随序号增加二倍递减；-.无菌生长；+.菌体较少；++.菌体较多

3.算盘子乙酸乙酯提取物对小鼠血清中MDA、SOD、GSH含量水平的影响：与正常组比较，模型组SOD、GSH水平显著降低(t=12.907，P<0.01；t=14.051，P<0.01)，MDA水平显著升高(t=-14.406，P<0.01)，差异有统计学意义，表明造模成功。与模型组比较，阳性组SOD、GSH水平明显升高(t=-4.914，P<0.05；t=-9.161，P<0.05)，MDA水平显著下降(t=7.060，P<0.01)。与模型组比较，高、低剂量组SOD水平明显升高(t=-7.688，P<0.01；t=-3.528，P<0.05)，GSH水平明显升高(t=-8.285，P<0.05；t=-5.415，P<0.01)，MDA水平显著下降(t=12.959，P<0.01；t=-4.573，P<0.05)，差异有统计学意义，详见表3。

4.乙酸乙酯提取物对小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β蛋白表达含量的影响：与正常组比较，模型组TNF-α、 IL-1β水平显著升高(t=-12.487，

表3 算盘子乙酸乙酯提取物对小鼠血清中MDA、SOD、GSH含量的影响

与正常组比较，*P<0．01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0．01

P<0.01；t=-14.136，P<0.01)，IFN-γ水平显著降低(t=9.869，P<0.01)，差异有统计学意义，表明造模成功。与模型组比较，阳性组TNF-α、IL-1β水平显著降低(t=8.827，P<0.01；t=7.633，P<0.01)，IFN-γ水平显著提高(t=-6.449，P<0.01)，与模型组比较，高、低剂量组TNF-α水平显著降低(t=7.677，P<0.01；t=4.534，P<0.05)，IL-1β水平显著降低(t=9.369，P<0.05；t=4.813，P<0.05)，IFN-γ水平显著提高(t=-6.848，P<0.05；t=-5.366，P<0.05)，差异有统计学意义，详见表4。

表4 算盘子提取物对小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β表达的影响

与正常组比较，*P<0．01；与模型组比较，#P<0．05，##P<0．01

5.小肠、肝脏、肾组织病理结果：光镜下可见，正常组小鼠肠黏膜完整，绒毛排列整齐。模型组肠黏膜厚度增加，细胞排列紊乱，肠绒毛形状改变及破坏，出现明显的炎性细胞浸润。高剂量组肠黏膜紊乱及炎性细胞浸润明显改善，阳性组与低剂量组得到不同程度的改善。正常组小鼠肝窦排列整齐，模型组有明显的肝窦充血，肝窦细胞紊乱，出现广泛的炎性细胞浸润。高剂量组肝窦细胞较为整齐，尽有少量炎性细胞浸润现象，阳性组与低剂量组有轻微的改善。正常组小鼠肾小球结构完整，形状规则。模型组肾小球出现结构破坏及明显萎缩。高剂量组与阳性组肾小球结构完整，萎缩程度较轻。低剂量组肾小球结构出现轻度破坏及萎缩。通过上述可知，大肠杆菌腹腔感染可对小鼠小肠、肝脏、肾组织造成损伤，算盘子具有保护、修复组织损伤的作用，详见图2。

6.乙酸乙酯提取物对小鼠小肠组织局部NF-κB、MMP-9、CRP蛋白表达水平的影响：与正常组比较，模型组NF-κB、MMP-9、CRP蛋白阳性表达显著提高(t=-22.008，P<0.01；t=-19.273，P<0.01；t=-15.194，P<0.01)，差异有统计学意义。与模型组比较，阳性组NF-κB、MMP-9、CRP蛋白阳性表达显著降低(t=13.538，P<0.05；t=6.021，P<0.05；t=7.778，P<0.05)，与模型组比较，高、低剂量组NF-κB表达显著降低(t=16.132，P<0.01；t=4.365，P<0.05)，MMP-9表达显著降低(t=14.862，P<0.01；t=5.033，P<0.05)，CRP表达显著降低(t=13.203，P<0.01；t=5.847，P<0.05)，差异有统计学意义，详见表5、图3。

表5 小鼠小肠组织中NF-κB、MMP-9、CRP累积吸光度

与正常组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

讨 论

大肠杆菌性腹膜炎是临床常见的感染性炎症，其主要由肠道菌群移位诱发机体发生炎症，生成大量自由基，诱发氧化应激反应，使对活性氧簇ROS清除能力下降，并导致肠道功能紊乱[3]。如感染未能控制可加重肠道黏膜的破坏和功能紊乱，并损伤周边组织器官，促发全身炎症反应综合征。天然药物算盘子含有黄酮类物质、没食子酸及槲皮素等抗菌抗炎成分[4]。本研究根据临床疾病常见病原菌大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对算盘子进行不同极性组分的抑菌实验，模拟药物在体内的抑菌作用。结果显示算盘子的乙酸乙酯提取物能够相对更有效地抑制菌群生长，故取乙酸乙酯提取物进一步实验。

图2 各组小鼠小肠、肝脏、肾组织切片HE染色图(×100)A.正常组;B.模型组;C.阳性组;D.高剂量组;E.低剂量组；Ⅰ.小肠组织;Ⅱ.肝脏组织；Ⅲ.肾组织

图3 小鼠肠组织中NF-κB、MMP-9、CRP的表达水平(HE,×100)A.正常组；B.模型组；C.阳性组；D.高剂量组；E.低剂量组；Ⅰ.NF-κB；Ⅱ.MMP-9；Ⅲ.CRP

通过小鼠腹腔注射大肠杆菌模拟疾病模型进行算盘子乙酸乙酯提取物体内抗炎实验。结果显示，腹腔注射大肠杆菌能够引起小鼠腹腔细菌性感染及肠道黏膜损伤，产生炎性反应，生成大量自由基导致氧化应激反应，同时对肝脏、肾脏重要器官也会造成影响。主要炎性因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ是由单核-吞噬细胞、T细胞等分泌的具有广泛生物学活性的细胞因子。其中TNF-α具有多种免疫调节作用，可以介导多种炎性因子释放，参与感染和组织修复等多种病理生理过程[5]。IL-1β是由巨噬细胞表达和分泌的炎性细胞因子，能促进其他细胞因子的表达，引起炎性反应和组织损伤[6]。IFN-γ作为一种重要的促炎因子，可引起肠黏膜屏障损伤[7]。MMP-9是由炎性细胞分泌的重要的蛋白水解酶，其表达与细胞炎症密切相关。CRP是非特异性反应中最主要、最敏感的标志物之一，具有激活补体、促进吞噬细胞的活性、刺激单核细胞表面的组织因子表达的功能，其水平与炎性反应及组织损伤密切相关[8]。组织病理切片显示感染后出现肠道炎症的发生和对黏膜的破坏，并对腹腔重要器官肝脏、肾脏产生炎性损伤。

氧化应激状态也是组织损伤的主要原因，SOD水平的高低反映内源性氧自由基清除系统的强弱[9]。MDA是脂质过氧化反应的最终产物，是组织细胞损伤的重要标志[10]。GSH 作为细胞内一种重要的调节代谢剂和抗氧化剂，具有清除氧自由基、增强抗氧化物酶活性、提高抗氧化防御能力[11]。NF-κB是一种调控因子，可同时参与氧化应激、炎性反应，其活化后可导致多种细胞因子如TNF-α、IL-1β的表达增强，从而使炎性反应加剧[12]。实验结果显示算盘子乙酸乙酯提取物治疗后小鼠血清中SOD、GSH与IFN-γ的含量明显升高，而MDA、TNF-α及IL-1β的含量下降，肠组织NF-κB、CRP、MMP-9蛋白的表达显著降低，且具有剂量依赖性。提示当大肠杆菌腹腔感染发生后产生炎性反应和氧化应激反应，使TNF-α、IL-1β含量升高，IFN-γ含量降低，诱导NF-κB、MMP-9、CRP蛋白的表达，进一步导致组织损伤。算盘子乙酸乙酯提取物能有效地调控炎性因子及氧自由基的含量，使SOD、MDA、GSH三者维持正常水平[13]。同时抑制NF-κB、CRP、MMP-9等蛋白的表达，减轻肠道过度炎性反应及组织器官的氧化应激作用，有效地抑制瀑布式炎性反应，从而达到抗炎、抗氧化应激的作用。

综上所述，算盘子乙酸乙酯提取物对大肠杆菌性腹膜炎具有一定的治疗效果，其作用机制可能是通过抑菌、抗炎、抗氧化应激作用实现的。