上调NDRG1表达降低奥沙利铂耐药结肠癌细胞的存活率

崔 喆，商 震，谷 乐，徐 兰

0 引言

结直肠恶性肿瘤发病率在我国有逐年上升趋势，年轻患者增多[1]，随着奥沙利铂(Oxaliplatin，OHP)在化疗中的引入，结直肠癌的生存期得到延长[2]，其靶向药的研发及临床应用，进一步提高了晚期结直肠癌患者的无病生存期及总生存期[3]。靶向药物与化疗联合应用，包括免疫治疗的引入，可能延长晚期结直肠癌的生存期[4]。NDRG1(N-myc downstream regulated gene1)为人N-myc下游调节基因，在结直肠恶性肿瘤中为抑癌基因，对细胞的分化、增殖及凋亡等功能具有重要的调控作用[5]。奥沙利铂耐药是导致患者治疗终止的主要原因之一，针对靶基因进行调控，可能改善结直肠肿瘤奥沙利铂耐药。本研究对结肠癌细胞奥沙利铂毒性反应及奥沙利铂耐药细胞在上调NDRG1表达后的反应进行了检测，并初步探讨了其可能机制，目的在于探索改善结肠癌细胞化疗耐药的靶基因，作为进一步实验研究的基础。

1 材料方法

1.1 材料 细胞株(SW480、SW620、HCT116)购自中科院上海细胞库，细胞培养采用L-15细胞培养基(含有10%胎牛血清，中国医科大学中心实验室)，以持续的自低向高的浓度梯度给予奥沙利铂于细胞培养液中，建立奥沙利铂耐药的稳定HCT 116细胞株(OHP-HCT 116),继续进行培养并进行传代。耐药细胞株建立时奥沙利铂以4 μmol/L为起始浓度，对存活及融合达到75%的细胞株进行传代，经过3代后进行奥沙利铂浓度的提高，浓度提高顺序为4、8、12、15、20 μmol/L，继续传代5代，即为奥沙利铂耐药的OHP-HCT 116组，HCT 116组为非耐药组，MOCK为空白对照组，siNC为阴性转染对照组。上调NDRG1表达的商业化质粒(pEGFP-NDRG1-N3)由大连宝生生物科技有限公司设计合成。研究中所用NDRG1多克隆抗体、p53单克隆抗体及Bcl-2单克隆抗体由北京中杉金桥公司提供。qRT-PCR逆转录试剂盒购自美国Santa-Cruz，MTT试剂盒及流式细胞凋亡检测试剂盒购自美国Sigma公司。引物设计及合成由南京浩博生物技术有限公司提供，以下所有试验均重复3次。

1.2 研究方法

1.2.1 MTT(Methyl-thiazolyl-tetrazolium)法 MTT法进行奥沙利铂干预后细胞存活率测定，判断化疗毒性。取对数生长期细胞(SW480、SW620、HCT116、OHP-HCT 116)，对细胞悬液进行浓度调整，37 ℃及5%CO2条件下进行孵育，在96孔板进行细胞接种(密度：5×104/ml，复孔：5个)，培养基中进行72 h的培养，加MTT液(20 μl/孔)，37 ℃条件下进行4 h的孵育，去除上清液，加150 μl二甲基亚砜，在摇床上进行震荡约10 min，上酶联免疫仪，在OD490 nm进行光密度值的测量，实验进行3次重复后分析。

1.2.2 qRT-PCR法(Quantitative real time polymerase chain reaction，即时定量聚合酶链锁反应)

首先进行抽提样品RNA：冰冻细胞进行裂解及溶解后，按Trizol试剂盒说明书进行两相分离沉淀RNA，依次进行清洗及干燥RNA，将RNA沉淀溶解。然后以紫外吸收法及变性琼脂糖凝胶电泳法检测RNA质量(包括浓度及纯度测定)；进行样品cDNA的合成，反应体系：逆转录buffer 2 μl、DEPC水 5 μl、dNTP 0.1 μl、逆转录酶MMLV 0.5 μl、RNA模版2 μl、上游引物 0.2 μl、下游引物 0.2 μl，总体积为10 μl。进行RT-PCR步骤，包括制备管家基因β-actin标准梯度，将检测样品及阳性标准品上RT-PCR仪进行标准曲线DNA模板的制定。对目标基因进行qRT-PCR，反应体系如下：SYBR Green 1染料10 μl、上游引物F 1 μl、下游引物R 1 μl、dNTP 1 μl、Taq聚合酶2 μl、待测样品cDNA 5 μl、ddH2O 30 μl,总体积50 μl。上RT-PCR仪，反应条件如下：93 ℃ 2 min、93 ℃ 1 min、55 ℃ 2 min，共40个循环，共40个循环，73 ℃条件下延伸7 min后进行溶解曲线的分析。

1.2.3 Western blot免疫印迹法 按试剂盒操作要求对已经用裂解液裂解的细胞进行蛋白的抽提，将蛋白样品收集后测定浓度，蛋白给予上样，以100 min电压100 V的条件进行电泳，用PVDF膜进行冰浴后转到膜上，给予漂洗蛋白膜后进行封膜，室温条件下进行60 min的封闭，将封闭液除尽，加入稀释完成的Ⅰ抗，摇床上以温度4 ℃给予1 h孵育后进行Ⅰ抗回收，给予洗涤，加入Ⅱ抗。摇床上以温度4 ℃给予1 h孵育后进行Ⅱ抗回收，10 min洗涤后ECL进行蛋白检测及发光，对灰度值给予分析。

1.2.4 转染 长期的细胞消化为单细胞悬液并接种于24孔板，24 h后进行转染操作。选择融合度高于75%细胞，依照试剂盒要求步骤，以pEGFP-NDRG1-N3或阴性对照组(siNegaive control，siNC)转染，转染结束后继续进行48 h培养，与空白对照组(MOCK组)及siNC组进行对比，以qRT-PCR及Western blot法检测转染效率。

1.2.5 流式细胞法检测细胞凋亡 按凋亡检测试剂盒要求的操作步骤，取各组对数期生长细胞，按说明书步骤进行操作，应用流式细胞仪对细胞凋亡进行检测，并以Cell Quest软件进行结果分析，实验重复3次，对凋亡率取平均值进行分析。

2 结果

2.1 奥沙利铂对不同人结肠癌细胞及奥沙利铂耐药HCT 116细胞的毒性作用 分别以不同浓度梯度(0、10、20、40、80)μmol/L的奥沙利铂对SW480、SW620、HCT 116及OHP-HCT 116细胞的毒性作用进行了对比，结果显示，HCT 116细胞对奥沙利铂最敏感，OHP-HCT 116细胞表现出对奥沙利铂的耐药性，见图1。

图1 奥沙利铂对不同人结肠癌细胞及奥沙利铂耐药HCT116细胞的毒性作用

2.2 qRT-PCR及Western blot检测转染效率 以脂质体介导的重组真核表达质粒pEGFP-NDRG1-N3分别转染HCT 116细胞及OHP-HCT 116细胞，以qRT-PCR和Western blot分别进行转染后效率检测，在HCT116细胞，与MOCK组及siNC组比较，pEGFP-NDRG1-N3组NDRG1在mRNA及蛋白水平表达均明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，转染效率约65%，见图2A；在OHP-HCT 116细胞，与MOCK组及siNC组比较，pEGFP-NDRG1-N3组NDRG1在mRNA及蛋白水平表达均明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，转染效率约70%，见图2B。

2.3 上调NDRG1表达对HCT 116细胞及OHP-HCT 116细胞存活率的影响 分别以不同浓度梯度(0、10、20、40、80 μmol/L)的奥沙利铂干扰HCT 116细胞及OHP-HCT 116细胞，以MTT法检测细胞存活率。结果显示，在HCT 116细胞，转染pEGFP-NDRG1-N3细胞存活率下降，在浓度为40、80 μmol/L差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。在OHP-HCT 116细胞，转染pEGFP-NDRG1-N3细胞存活率下降，在浓度为40、80 μmol/L差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。结果表明，上调NDRG1表达能降低结肠癌细胞及奥沙利铂耐药细胞的存活率，这种效应具有奥沙利铂剂量依赖性。

2.4 上调NDRG1表达对HCT 116细胞及OHP-HCT 116细胞凋亡的影响 流式细胞术显示，与MOCK及siNC组比较，HCT 116组及pEGFP-NDRG1-N3 OHP-HCT 116组细胞凋亡率升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

图2 以qRT-PCR及Western blot对pEGFP-NDRG1-N3在结肠癌HCT 116细胞(A)及OHP-HCT 116细胞中(B)转染效率检测

表1 不同浓度奥沙利铂处理的HCT 116细胞存活率变化(%)

表2 不同浓度奥沙利铂处理的OHP-HCT 116细胞存活率变化(%)

图3 上调NDRG1表达对HCT 116细胞及OHP-HCT 116细胞凋亡的影响

2.5 上调NDRG1表达对p53、Bcl-2蛋白的影响 Bcl-2、p53是mTOR通路重要蛋白之一，为了验证NDRG1是否通过mTOR信号通路调控结肠癌细胞的凋亡及奥沙利铂耐药，采用Western blot检测上调pEGFP-NDRG1-N3表达HCT 116细胞及OHP-HCT 116细胞Bcl-2及p53蛋白表达水平的变化。

结果显示，与MOCK及siNC组比较，p53在HCT116细胞及OHP-HCT 116细胞表达升高(P<0.05)见图4A；与MOCK及siNC组比较，Bcl-2在HCT 116细胞及OHP-HCT 116细胞表达降低(P<0.05)，见图4B。

图4 Western blot检测上调NDRG1表达Bcl-2及p53蛋白水平变化

3 讨论

结直肠恶性肿瘤治疗中，由于奥沙利铂化疗的引入，晚期结直肠癌的无病生存期及总生存率均有一定程度提高，但结直肠癌细胞奥沙利铂耐药也是导致化疗进行到一定阶段治疗效果减弱及丧失的主要原因[6-7]。靶向药物与化疗进行综合治疗能够进一步延长患者无病生存时间，并可能延长化疗药物耐药出现的时间[8-9]。有研究显示，NDRG1在肺癌、宫颈癌及卵巢癌等恶性肿瘤组织中表达低于正常组织，在结直肠癌中NDRG1表达也低于正常结直肠组织[10-11]。毛志海等[12]研究认为，在结直肠恶性肿瘤中，NDRG1是抑癌基因，对结直肠癌患者预后风险具有判断价值。NDRG1对肿瘤的转移、侵袭、凋亡及增殖等具有调控作用，可能作为抑癌基因，通过对下游通路的调控介导肿瘤细胞的恶性生物学行为。因此，在结直肠癌细胞中对NDRG1进行上调，可能成为潜在的治疗靶基因。

本研究对奥沙利铂在结肠癌细胞及HCT 116奥沙利铂耐药细胞株的毒性作用进行了分析，结果显示，成功构建了奥沙利铂耐药HCT 116细胞，pEGFP-NDRG1-N3转染也达到了50%以上的效率，进一步细胞存活率实验显示，HCT 116细胞及奥沙利铂耐药的HCT 116细胞在上调了NDRG1表达后，均表现出了存活率下降及凋亡率增高，奥沙利铂耐药细胞株的耐药性也得到了部分逆转，说明上调NDRG1表达能够降低结肠癌HCT 116细胞的增殖活性，增加其凋亡，对奥沙利铂耐药细胞的耐药性也具有一定逆转作用。研究显示，对宫颈癌SiHa细胞NDRG1表达进行上调，宫颈癌细胞增殖活性减低，这种减低可能是NDRG1调控COX-2及VEGF表达实现的[13]。在肺腺癌A549细胞中的研究显示，上调A549细胞中NDRG1表达后细胞存活率降低，凋亡率升高，可能是通过调控p21及MDM2表达实现对A549细胞增殖及凋亡的调控。毛志海等[14]研究认为，NDRG1可能是通过激活下游的PAK1表达介导MLC2磷酸化，抑制F-actin占主体的细胞骨架重构而对结直肠癌迁移行为进行调控。另有研究认为，缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)从上游调控NDRG1表达，从而介导结肠癌细胞分化能力[15]。本研究显示，NDRG1表达上调后，在HCT 116细胞及奥沙利铂耐药的HCT 116细胞中p53表达升高，Bcl-2表达降低。p53作为抑癌基因，在细胞周期G期对DNA的完整性进行监视，对DNA损伤而不能修复细胞诱发凋亡[16]，p53对Bcl-2具有特异性的抑制作用，p53水平的升高抑制了Bcl-2的表达，从而诱发细胞凋亡[17]。本研究显示，上调NDRG1表达后p53及Bcl-2水平均发生了改变，这表明，NDRG1可能对p53具有直接或间接调控作用，继而抑制了Bcl-2表达降低，从而细胞凋亡增加。NDRG1对结肠癌细胞增殖及凋亡的控制可能是多基因多通路共同参与的，包括对下游mTOR通路调控，并接受上游基因的调控等[18-20]。

本研究观察了上调NDRG1对奥沙利铂干预的结肠癌细胞及奥沙利铂耐药结肠癌细胞的毒性作用，结论为上调NDRG1通过p53对结肠癌细胞奥沙利铂化疗增效，并对奥沙利铂耐药结肠癌细胞耐药性具有改善作用，但NDRG1对奥沙利铂干预的结肠癌细胞及奥沙利铂耐药结肠癌细胞的作用机制需进一步研究。