miR-32与PTEN在宫颈癌中表达关系

（南华大学附属郴州市第一人民医院 423000）

宫颈癌是我国最常见的妇科恶性肿瘤之一，晚期宫颈癌患者，由于容易出现的复发、转移和耐药，目前疗效并不理想[1]。PTEN是一种肿瘤抑制基因，在细胞生长、凋亡、迁移、浸润等方面有重要作用[2]。前期工作中，发现，miR-32与PTEN结合最稳定，特异性最好。本项目拟研究miR-32和PTEN在宫颈癌发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

鼠抗人单克隆PTEN、β-actin抗体，脂质体，美国Santa Cruz公司产品。Transwell试剂盒、Matrigel基质胶，美国B&D公司产品。

1.2 miR-32 mimics、NC 及 inhibitors

试剂均由广州博锐生物科技有限公司合成。

1.3 qRT-PCR

在实时荧光定量PCR仪上进行PCR反应。qRT-PCR反应体系如下：10μM正向引物1μl;10μM反向引物 1μL;DNA模板 2μL;ddH2O 8.5μL;2×SYBR Primix Ex TaqTMⅡ12.5μL;总反应体系25μL。按以下过程进行：95℃，5 min；35 个 PCR 循环（95℃，10sec；59℃，15sec；72℃，20sec；82℃，5sec）。

1.4 Western blot

:步骤如下：分别收集细胞约108个，抽提细胞的总蛋白；蛋白样品加热变性；SDS-PAGE电泳；转膜：电压设置为100V，时间约1h；丽春红溶液中染色3-5min；封闭1-2h；加入适量的封闭液和一抗(一抗浓度为1:1500)；再加封闭液和生物素进行标记的二抗(二抗浓度为1:1000)，常温下孵育1-2h；压X光片，定影显影，洗片，图像扫描。

1.5 重组细胞系的建立

首先采用脂质体转染试剂盒(Lipofectamine 2000)将miR-32 mimics、NC及inhibitors序列分别通过脂质体方法转染宫颈癌Hela细胞系，获得三个重组细胞株：Hela-miR-32 mimics、Hela-miR-NC、Hela-miR-32-inhibitors。

1.6 统计学分析：采用SPSS18.0进行统计学分析，实验结果以均数±标准差表示，两两比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌组织与癌旁组织中miR-32和PTEN表达关系

miR-32在宫颈癌组织中高表达，而在癌旁组织中低表达；PTEN在宫颈癌组织中低表达，在癌旁组织中高表达，差异有显著性意义（P＜0.05，图 1）。

图1 宫颈癌和癌旁组织中miR-32和PTEN表达关系

2.2 miR-32与PTEN表达关系

Hela-miR-32 inhibitors细胞株中，miR-32表达水平下调后，导致PTEN表达水平增高；Hela-miR-32 mimics细胞株中，提高miR-32表达水平后，PTEN蛋白水平下调，差异均有显著性意义（P＜0.05，图2）；而Hela和Hela-miR-NC比较，差异均无显著性意义。

图1 重组细胞系中miR-32与PTEN表达关系

4 讨论

研究发现，PTEN基因在宫颈组织从癌前病变向宫颈癌演变的过程中有重要作用;PTEN基因的功能缺失使其对肿瘤细胞生长抑制及对细胞黏附的控制减弱，有助于宫颈癌的发生[3，4]。PTEN也可作为评价宫颈癌预后的指标[5]。本研究发现，宫颈癌组织中PTEN低表达，癌旁组织中高表达，两者之间的差异有统计学。PTEN与宫颈癌发生发展有关。

研究表明，miRNA的表达异常与宫颈癌的发生、发展有着直接的联系[6]。有研究发现，miRNA-27b在宫颈癌中表达增高，下调miRNA-27b表达水平后，宫颈癌细胞的生长受到明显抑制[7]。本研究发现：宫颈癌组织中出现同时miR-32高表达和PTEN低表达，而癌旁组织中同时出现miR-32低表达和PTEN高表达。说明miR-32与PTEN表达均与宫颈癌发生发展相关，miR-32与PTEN表达具有负相关。同时，宫颈癌细胞中，miR-32表达下调后，导致PTEN表达水平增高；而提高miR-32表达后，PTEN蛋白水平下调，结合前期工作在生物信息学分析，本研究认为PTEN可能是miR-32的下游靶基因。他们之间的靶向结合与宫颈癌的关系值得进一步研究。