胞嘧啶脱氨基酶APOBEC1研究进展

周冰涵 严小璇 蓝文贤 王春喜 曹春阳

摘 要： 为全面理解载脂蛋白B mRNA（ApoB mRNA）编辑酶催化多肽-1（APOBEC1）的作用机制，介绍了APOBEC1和ApoB mRNA的蛋白及核酸序列，总结并绘制了APOBEC1与不同的辅助蛋白的结合模型，阐述了APOBEC1催化ApoB mRNA第6 666位的胞嘧啶（C₆₆₆₆）脱氨基化分子机制.列举了啮齿动物APOBEC1抑制多种逆转录病毒的研究报道，介绍了兔源APOBEC1结合人类免疫缺陷病毒1（HIV-1）的病毒粒子并编辑病毒基因组的机理.同时介绍了APOBEC1通过编辑胞嘧啶或与AU富集元件（ARE）结合来调控癌症等疾病相关的细胞因子表达.

关键词： 载脂蛋白B mRNA（ApoB mRNA）; 载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽-1（APOBEC1）; 胞嘧啶脱氨基化

中图分类号： Q-71  文献标志码： A  文章编号： 1000-5137（2020）02-0234-11

Research advances on cytosine deaminase APOBEC1

ZHOU Binghan^1，2， YAN Xiaoxuan²， LAN Wenxian²， WANG Chunxi²， CAO Chunyang^2*

（1.College of Chemistry and Materials Science，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China; 2.State Key Lab of Bio-organic and Natural Products Chemistry，Shanghai Institute of Organic Chemistry，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 200032，China）

Abstract： In order to fully understand the mechanisms of Apolipoprotein B mRNA（ApoB mRNA） editing enzyme catalytic polypeptide-1（APOBEC1），this review introduced the amino acid and nucleic acid sequences of APOBEC1 and ApoB mRNA，summarized and mapped the binding models of APOBEC1 with different cofactors to explain the molecular mechanism of APOBEC1 catalyzing the deamination of the 6666 C of ApoB mRNA （C₆₆₆₆）.The researches of rodent APOBEC1 inhibiting multiple retroviruses were exemplified here，and the related mechanisms of rabbit APOBEC1 binding to human immunodeficiency virus type 1（HIV-1）and editing the viral genome were discussed.This review also introduced APOBEC1 regulating the expression of cytokines related to cancers and other diseases by deamination editing or combining with AU-rich element（ARE） of RNAs.

Key words： apolipoprotein B mRNA（ApoB mRNA）; ApoB mRNA editing enzyme catalytic polypeptide-1（APOBEC1）; cytidine deamination

0 引 言

载脂蛋白B mRNA（ApoB mRNA）编辑酶催化多肽（APOBEC家族）是一类胞嘧啶脱氨基酶，能催化单链RNA或单链DNA中的胞嘧啶脱氨基转化为尿嘧啶.APOBEC家族由活化诱导胞嘧啶脱氨基酶（AID），ApoB mRNA编辑酶催化多肽-1（APOBEC1），APOBEC2，APOBEC3亚家族（APOBEC3A，APOBEC3B，APOBEC3C，APOBEC3D，APOBEC3E，APOBEC3F，APOBEC3G，APOBEC3H），以及APOBEC4组成.其中APOBEC1与AID串联排列于第12号染色体，APOBEC2位于第6号染色体，APOBEC3亚家族以串联重复的方式排列于第22号染色体^[1]，APOBEC4则位于第1号染色体^[2]，如图1（a）所示.APOBEC家族成员脱氨基催化活性由1个或2个锌指结构域提供，位于锌指结构域的氨基酸序列在APOBEC家族中相当保守：His-X-Glu-X_23–28-Pro-Cys-X_2-4-Cys（其中X表示任何氨基酸）;AID，APOBEC1，APOBEC3A，APOBEC3C，APOBEC3H为单锌指催化结构域;APOBEC3B，APOBEC3D，APOBEC3F，APOBEC3G则含有2个锌指催化结构域，如图1（b）所示，而APOBEC2与APOBEC4暂无结构相关报道^[2].APOBEC家族中研究最深入的是AID与APOBEC3亚家族，两者都有以DNA為底物的高效脱氨基催化活性，最广为人知的功能是在外源性病毒逆转录过程中对DNA进行编辑，使病毒DNA发生降解以抑制病毒逆转录过程，如人源APOBEC3G编辑人类免疫缺陷病毒1（HIV-1）DNA以抑制HIV-1在人体中的复制.

APOBEC1是一种RNA胞嘧啶脱氨基酶，可特异性编辑ApoB mRNA，编辑DNA不是其主要功能^[1].其功能特征具体体现在如下几个方面：1） 与AID/APOBEC3相似的是，啮齿动物，尤其兔源APOBEC1蛋白通过RNA/DNA胞嘧啶脱氨基化的机制，抑制某些逆转录病毒的复制;2） 随着更多的APOBEC1编辑靶标的鉴定，发现APOBEC1在包括癌症等疾病发生方面具有一定作用;3）APOBEC1也是APOBEC家族中唯一需要与特定的辅助蛋白形成复合物才能进行ApoB mRNA编辑的蛋白^[3-4].

近年来关于APOBEC1的研究范围越来越广，不再局限于ApoB mRNA的脱氨基化研究.APOBEC1在体内有大量RNA靶标，催化脱氨基化也不是其参与生理过程的唯一机制.为全面了解APOBEC1功能，促进APOBEC1在相关领域的研究，本文作者总结了近年来APOBEC1在生物功能方面的研究进展，介绍了基于同源建模预测的APOBEC1编辑胞嘧啶脱氨基化的分子机制，APOBEC1与辅助蛋白如何形成复合物识别并编辑ApoB mRNA的机制，和APOBEC1在逆转录病毒以及疾病方面的研究成果.

1 APOBEC1研究进展

1.1 APOBEC1功能域及结构研究

APOBEC1最初在ApoB mRNA编辑事件中被发现.人源APOBEC1与兔源APOBEC1包含236个氨基酸（aa），大鼠APOBEC1与小鼠APOBEC1包含229aa，人源APOBEC1与大鼠APOBEC1具有69%的序列相似性^[5]，构成锌指结构域的脱氨基活性位点H-X-E-X_23-28-C-P-X_2-4-C在APOBEC1同源蛋白中也十分保守^[4];N端的碱性氨基酸R15，R16，R17，R33和K34被认为是核定位信号的一部分^[6-7]，它们对编辑反应很重要^[8].MEHTA等^[9]发现，APOBEC1的N端区域可能参与辅助蛋白的结合.APOBEC1蛋白均在C端173～210 aa处具有一段保守的亮氨酸富集区域180～196 aa.L180，L182，I185和L189的单突变体，以及P190A/P191A双突变体均导致APOBEC1部分或几乎完全失去编辑活性^[8].同位素标记以及高效液相色谱分析显示：APOBEC1可能以同源二聚体的方式存在^[10]，而APOBEC1的C端残基196～210 aa和221～229 aa对二聚体的形成有很重要的影响^[8]，如图2所示.其次C端缺失的APOBEC1突变体（APOBEC1截短体1～172 aa和截短体1～196 aa）无法二聚并且无法编辑ApoB mRNA^[8，11]，IKEDA等^[5]发现APOBEC1的二聚结构需要RNA分子的介导.APOBEC1还能对单链DNA的胞嘧啶进行脱氨基催化^[12]，基于酵母脱氨酶晶体结构模拟的APOBEC1结构模型支持这一结论^[13].IKEDA等^[5]发现兔源APOBEC1的C端亮氨酸富集区以及2个二聚体结构域均参与了其包装到HIV-1病毒粒子中的过程，C端结构域同时也是APOBEC1对病毒cDNA和基因组RNA发挥脱氨基活性必不可少的部分.

1.2 APOBEC1催化胞嘧啶脱氨基化的可能机制

APOBEC1能够特异性催化ApoB mRNA第6666位的胞嘧啶C₆₆₆₆脱氨基化转变为尿嘧啶（U₆₆₆₆），即ApoB mRNA C-to-U编辑，该处密码子则由C₆₆₆₆AA（Q2153）突变为终止密码子U₆₆₆₆AA，经过编辑的ApoB mRNA翻译后得到ApoB蛋白的截短体ApoB48（相对分子质量为241 000），未经编辑的ApoB mRNA则翻译为全长的ApoB100（相对分子质量为512 000）^[14]，如图3（a）所示.ApoB100在血液中运输内源性胆固醇和甘油三酸酯，而截短体ApoB48可代谢膳食脂类^[15]，但ApoB100结合胆固醇并在血液中运输时有可能增加动脉粥样硬化的风险^[16]，所以APOBEC1对ApoB mRNA的脱氨基催化产物ApoB48可能降低动脉粥样硬化的风险.APOBEC1催化活性中心是一个锌指结构域，如图1（b）所示，脱氨基化活性位点为His-X-Glu-X_23-28-Cys-Pro-X_2-4-Cys^[4]，主要识别底物是RNA，也有研究报道APOBEC1能对DNA胞嘧啶催化脱氨基化^[12，17].HARRIS等^[1]根据细菌以及酵母胞嘧啶脱氨酶的结构研究预测了APOBEC蛋白对单链DNA脱氨基催化的分子机制，如图3（b）所示.首先，活性位点的组氨酸（His）和半胱氨酸（Cys）与锌离子（Zn²⁺）配位，此时一个水分子靠近活性位点;随后水分子在Zn²⁺作用下与谷氨酸（Glu）反应后生成一个氢氧根离子（OH^-），激活了锌指结构域;激活后的Glu将胞嘧啶环的N3质子化，导致N3与C4双键不稳定，此时C4易于OH^-的进攻;OH^-进攻C4后其质子氢被Glu螯合，形成四面体的过渡态;最终，胞嘧啶的氨基侧基（-NH₂）接受了被Glu螯合的質子氢，使碳氮键断裂，C4重新与氧原子（O）形成双键并从活性位点处释放尿嘧啶和氨（NH₃），如图3（b）所示.APOBEC1催化DNA或RNA胞嘧啶脱氨基化可能也符合这一机制.

1.3 APOBEC1与辅助蛋白形成复合物对ApoB mRNA C₆₆₆₆脱氨基化

重组APOBEC1蛋白和细胞提取物的研究均证明仅凭单独的APOBEC1尽管能介导单胞嘧啶的脱氨基化反应，但不足以在体内或体外催化ApoB mRNA C-to-U编辑^[18-19]，需要与辅助蛋白APOBEC1互补因子（A1CF）或RNA结合模体蛋白-47（RBM47）形成有效的RNA编辑复合物^[20-22].在ApoB mRNA的C-to-U编辑中，能被编辑的最小序列长26个核苷酸（nt）^[23]，这段序列从有袋动物到人类都高度保守^[24-25].除被編辑位点C₆₆₆₆外，该序列还包含ApoB mRNA的位点特异性脱氨所需的其他3个顺式作用元件^[26-28].如图4所示，第一个元件是位于C₆₆₆₆下游的特异性结合序列（mooring sequence，11nt），特异性结合序列不可编辑^{[23，26，29]};第二个元件位于C₆₆₆₆和特异性结合序列之间的区域，称为间隔元件（spacer element，2～8 nt），最佳长度为4 nt^[28];第三个元件是富含AU的效率序列（efficiency sequence），位于C₆₆₆₆的上游，调节编辑反应的产量^[30].

1998年，RICHARDSON等^[18]提出被编辑的胞嘧啶核苷C₆₆₆₆周围的保守序列元件形成茎-环二级结构，其中C₆₆₆₆位于八环中.1999年，HERSBERGER等^[31]提出另一种二级结构，其中特异性结合序列和5'端的效率元件形成双链茎部，被编辑的胞苷位于单链区域而不是茎-环中.2005年，MARIS等^[30]使用核磁光谱法解析了ApoB mRNA（31nt）的茎-环状结构，构建了APOBEC1互补因子（A1CF）与ApoB mRNA的识别模型，如图5（a）所示，首先A1CF识别并结合特异性识别序列，将茎部的双链结构解构象，破坏ApoB mRNA坚固的二级结构，使其展开并暴露出编辑位点C₆₆₆₆，随后APOBEC1得以靠近C₆₆₆₆并将其突变为U₆₆₆₆.2010年，GALLOWAY等^[32]报道称A1CF可能以二聚体的形式参与ApoB mRNA编辑.2011年ZANTO等^[33]认为二聚体A1CF在体外可能更容易稳定结合特异性识别的RNA序列，如图5（b）所示.根据FOSSAT等^[4]构建的模型，如图5（c）所示，RBM47与APOBEC1及A1CF均有相互作用，RBM47的N端RNA识别模体（RRM）结合了ApoB mRNA特异性识别序列，A1CF与特异性识别序列的更下游结合，因为敲除A1CF不会对整个脱氨基模型产生影响.

1.4 APOBEC1的抗逆转录病毒活性

APOBEC3蛋白亚家族是HIV-1限制因子.作为其同源蛋白，APOBEC1在体外也具有对单链DNA的脱氨基活性^[12].但APOBEC1是否能调控病毒基因组从而影响病毒传播，是近年人们一直关注的研究方向.早期利用小鼠白血病病毒（MLV）或乙型肝炎病毒（HBV）的小鼠模型研究发现，APOBEC1还具有抗病毒活性，感染MLV的小鼠脾细胞或感染HBV的小鼠肝细胞均检测到受APOBEC1特异性编辑过的病毒基因组，表明APOBEC1通过编辑病毒基因抑制病毒^[34-35].近年的报道则揭示了更多逆转录病毒因子一定程度上受APOBEC1调控.GEE等^[36]第一次阐释了APOBEC1或有抵抗单纯疱疹病毒1（HSV-1）的作用，大鼠幼崽神经元在感染HSV-1期间能诱导APOBEC1表达，体外研究证明APOBEC1通过脱氨基作用直接抑制病毒DNA的复制，这些都暗示APOBEC1或许可以发展为大鼠在脑炎背景下新的HSV-1感染抑制剂.IKEDA等^[37]在细胞实验中发现来自多种哺乳动物的APOBEC1蛋白可以降低长散布核苷酸序列1（LINE-1）和长末端重复序列（LTRs）反转录转座子的迁移率和感染潜力，认为APOBEC1或许通过结合LINE-1的特殊RNA序列、LINE-1的开放阅读区，或逆转录相关的宿主蛋白的方式阻碍LINE-1逆转录.

研究表明来源于大鼠的APOBEC1能抑制HIV-1等外源性逆转录病毒的复制^[34，38-39]，IKEDA等^[40]发现来自小型啮齿动物的几种APOBEC1以及兔源APOBEC1能够不受病毒感染因子（Vif）的影响，通过其C端与HIV-1 Gag蛋白核衣壳结构域的相互作用，掺入HIV-1病毒粒子中从而抑制HIV-1复制，如图6所示，其中兔源APOBEC1因能更有效地掺入HIV-1病毒粒子中而显示出最大抑制活性.抑制作用大部分依赖APOBEC1对病毒RNA的胞苷脱氨基化活性，及对HIV-1原病毒DNA的脱氨基活性，对脱氨基活性位点Glu63的突变不影响APOBEC1掺入病毒粒子，却导致兔源APOBEC1的HIV-1的抑制作用大部分丧失.遗憾的是，与啮齿动物APOBEC1氨基酸序列相似性高达70%的人源APOBEC1却几乎不能抑制HIV-1^[38-42].为了发现参与APOBEC1识别病毒基因而抑制HIV-1感染的氨基酸序列，IKEDA等^[5]构建了一系列兔源和人源APOBEC1的嵌合蛋白.结果显示：兔源APOBEC1在C端的一段亮氨酸富集区域以及2个二聚化结构域不仅能帮助APOBEC1结合到HIV-1病毒粒子中，同时参与了APOBEC1对病毒DNA以及RNA的脱氨基过程.其他因素，如蛋白质的正确折叠与修饰、各种细胞因子的参与等，是APOBEC1发挥最大抗HIV-1活性所必需的.在未来的研究中，全面地阐明APOBEC1对病毒DNA/RNA催化脱氨基化的分子机制，有利于完善APOBEC家族保护宿主免受逆转录病毒侵害的防御机制.

尽管对APOBEC1抗逆转录病毒活性的研究已有很多，但近期一份针对APOBEC1缺陷小鼠的研究数据指出APOBEC1既不能限制急性FV（MLV病毒的一种）复制，也不能催化FV基因组突变^[43]，这与早期的体外研究结果相悖^[12，34].因此并非所有体外有效的逆转录病毒限制因子在体内都具有相关功能.基于某些限制因子，开发抗病毒策略可能为时过早，APOBEC1作为逆转录病毒限制因子是否具有生物意义，应该经过APOBEC1敲除的小鼠模型的筛选确定后才能进行深入的基础研究和转化研究^[44].

1.5 APOBEC1在肿瘤形成中的作用

对RNA的编辑和调节功能已被证实在肿瘤形成中起重要作用^[45-46].研究表明，DNA/RNA胞苷脱氨酶APOBEC家族诱变模式在人類癌症中也广泛存在^[47]，已经观察到多个APOBEC家族成员与癌症关联^[48-51].而APOBEC1曾被报道在哺乳动物体内很多不存在ApoB mRNA的组织中广泛表达^[43]，对基因转录组的大范围测序鉴定了32个新的受APOBEC1编辑的RNA靶标，这些靶标均位于RNA 3'-非翻译区（3'UTR）的AU富集元件（ARE）^[52].这些APOBEC1新的RNA靶标囊括了许多重要的细胞因子.通过调控RNA靶标，APOBEC1直接或间接参与了一些重要的生理过程.

APOBEC1结合环氧合酶2（COX-2）的mRNA，促进COX-2 mRNA稳定表达^[53]，是胃肠道环境中COX-2 mRNA的关键调节因子.APOBEC1基因缺失的小鼠小肠上皮细胞COX-2表达被抑制，导致其受辐射损伤产生的细胞凋亡水平增加^[53].敲除APOBEC1表达的APC^min/+小鼠，将减少因COX-2引起的胃肠道息肉和肿瘤的数量^[54].APOBEC1还在脑缺血大鼠的神经元细胞中以相同的方式上调COX-2蛋白的表达，以影响脑缺血大鼠的发炎症状^[55].由于APOBEC1在肠道、肝脏、树突细胞以及免疫系统中编辑了大量的转录物^[56-60]，APOBEC1的遗传失活将影响巨噬细胞中重要基因（如LAMP1，Rac1，Kras等）的表达水平，并影响它的特殊细胞功能^[56].APOBEC1还能结合原癌基因c-Myc mRNA的3'UTR以增加其稳定性^[61].在HuH7.5肝癌细胞系中，APOBEC1与异质核核糖核蛋白Q同种型6（hnRNPQ6）相互作用，共同稳定白细胞介素-8（IL8）mRNA，助长癌细胞生长^[62];

APOBEC1介导的RNA编辑与肿瘤形成的第一个直接联系是在1995年被发现的.在转基因兔和小鼠肝脏中过表达兔源APOBEC1最终导致肝脏发育不良和原发性肝癌^[63].随后研究证实了APOBEC1通过编辑转录因子来调节癌症相关基因的表达^[64]，如APOBEC1编辑神经纤维蛋白1（NF-1）mRNA，从而阻碍NF-1的肿瘤抑制功能，导致与1型神经纤维瘤相关的神经肿瘤发生^[65].敲除小鼠神经系统小胶质细胞中的APOBEC1基因致使中年小鼠大脑处于促炎环境，同时伴随着髓鞘形成异常、溶酶体表达异常，以及年龄相关的神经退化等一系列中枢神经系统病变^[66]，进一步研究发现APOBEC1编辑小胶质细胞中多个基因转录组，其中对溶酶体膜蛋白2（LAMP2）的mRNA脱氨基化，最终导致溶酶体丰度的降低，进而影响小胶质细胞的部分正常功能^[66]，显示RNA编辑或许能作为大脑疾病的预测指标.APOBEC1驱动的mRNA编辑还被证明与肺腺癌有关^[67]，对睾丸生殖细胞肿瘤（TGCT）小鼠模型的一项研究发现缺乏APOBEC1可影响TGCT易感性^[68]，这种影响以跨代的方式表现，暗示APOBEC1可能通过RNA编辑的方式调节表观遗传变化^[69].

概括来说，APOBEC1调控RNA主要通过2种方式：一是与RNA 3'UTR ARE结合来修饰转录因子，调控转录因子的衰变速度从而延长其寿命，最终使相关基因稳定表达^[55];二是直接编辑细胞因子的mRNA导致胞嘧啶突变为尿嘧啶.尽管有研究认为APOBEC1参与癌症的发病的机制可能是直接调控相关的DNA^[70]，但目前大部分成果显示APOBEC1通过上述2种方式调控癌症相关RNA的稳定性.

2 展 望

APOBEC1是APOBEC家族第一个被发现的成员，是ApoB mRNA C-to-U编辑的特异性脱氨基催化酶，通过与已知结构的同源蛋白序列比对、结构模拟以及一系列突变实验，已经确定了APOBEC1的锌指结构域、脱氨基催化活性位点、C端二聚结构域以及亮氨酸富集区.尽管如此，APOBEC1如何与辅助蛋白形成复合物编辑酶对ApoB mRNA进行C-to-U编辑，尚需APOBEC1相关的晶体、核磁或电镜结构的验证.但由于APOBEC1难以表达纯化，其结构研究一直进展缓慢.

APOBEC1自身能够靶向转录因子的AU序列，但在ApoB mRNA脱氨基过程中却需要辅助蛋白结合特异性识别序列，因为对C₆₆₆₆脱氨基化不仅需要固定ApoB mRNA，还要将底物坚固的茎环结构动态性增强，使C₆₆₆₆与APOBEC1催化活性中心相互靠近，才能最终发挥脱氨基活性.那么APOBEC1在调控其他转录因子，如结合COX-2 mRNA或编辑LAMP-2 mRNA时，是否需要辅助蛋白呢？研究这些mRNA是否具有与ApoB mRNA相似的坚固构象或许有助于解答这个问题.过去发现ApoB mRNA C-to-U编辑几乎都发生在细胞核中，而曾经假定的APOBEC1核定位信号（NLS）并不能引导APOBEC1定位于细胞核^[71]，APOBEC1的细胞核定位可能依赖辅助蛋白的运输^{[20，22，72]}，所以辅助蛋白不仅具备结合核酸底物的能力，而且在细胞核-细胞质运输方面也发挥着重要的作用.另外，使用26～102 nt的ApoB mRNA发现底物的增长将提高编辑效率^[72]，在FOSSAT等^[4]给出的模型中可以看到A1CF与特异性结合序列的下游结合.目前的实验尚不能完全模拟出体内ApoB mRNA底物状态，要阐释体内ApoB mRNA C-to-U编辑的真实分子机制，需要解析出ApoB mRNA-APOBEC1-RBM47-A1CF复合物的真实结构.随着对APOBEC1研究的不断深入，发现APOBEC1的脱氨基催化活性在抗逆转录病毒中发挥着作用，最引人注目的是啮齿动物和兔源APOBEC1具有不受Vif影响的抗HIV-1活性，其中兔源APOBEC1能够高效地掺入病毒粒子并直接编辑病毒基因组，但脱氨基活性位点Glu63的突变并不能完全消除兔源APOBEC1的HIV-1抑制作用，说明兔源APOBEC1还以一种较弱的，不同于脱氨基催化的机制抵抗HIV-1，阐明这种机制有助于加深对APOBEC家族抗病毒功能的理解.

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（責任编辑：郁 慧，顾浩然）

收稿日期： 2019-12-20

基金项目： 国家自然科学基金（21778065;91753119）

作者简介： 周冰涵（1995—），女，硕士研究生，主要从事结构生物学方面的研究.E-mail：bingham_Z@outlook.com

通信作者： 曹春阳（1970—），男，研究员，主要从事结构生物学方面的研究.E-mail：ccao@mail.sioc.ac.cn

引用格式： 周冰涵，严小璇，蓝文贤，等.胞嘧啶脱氨基酶APOBEC1研究进展 [J].上海师范大学学报（自然科学版），2020，49（2）：234-244.

Citation format： ZHOU B H，YAN X X，LAN W X，et al.Research advances on cytosine deaminase APOBEC1 [J].Journal of Shanghai Normal University（Natural Sciences），2020，49（2）：234-244.