黄芩苷对H22肝癌荷瘤小鼠瘤组织HMGB1、MMP2和MMP9表达的影响

鲁兴梅 ，于 越，郭 燕，李海龙 ，李志成 ，周迎霞 ，王宏伟

（1.甘肃卫生职业学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省中医药大学，甘肃 兰州 730000；3.兰州市人民医院，甘肃 兰州 730050；4.甘肃省中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730000）

中医临床研究认为肝癌的主要病因是“瘀毒内盛”，中医药是通过“解毒散结”治疗肝癌的[1]。黄芩为常用中药材，《神农本草经》记载，其性寒、味苦，具有清热燥湿，泻火解毒”等功效。中医古籍中有用黄芩配伍方剂“化瘤丹”“化瘤膏”医治瘤、痼等病症的记载。现代药理研究发现，黄芩可以提高肿瘤治疗效果[2]。黄芩苷属于黄酮类化合物，提取分离自中药材黄芩干燥根，是黄芩最主要的有效成分[3]。本研究观察黄芩苷对H22肝癌荷瘤小鼠瘤组织HMGB1、MMP2和MMP9表达的影响，探析黄芩苷对肝癌的可能作用机理，为临床治疗肝癌提供实验依据。

1 材料

1.1 实验动物

SPF 级昆明小鼠 60只，雌雄各半，体质量（20±2）g，6～8 周龄，甘肃中医药大学实验动物中心提供，实验动物使用许可证号：SYXK（甘）2016—0007。小鼠每笼5只，雌雄分笼，空气流通，噪音 ＜80～85 dB，湿度 45%～55%，温度 20℃～25℃。标准动物饲料由甘肃中医药大学实验动物中心提供，自由饮水和摄食。

1.2 细胞株

H22小鼠肝癌细胞株，上海和元生物技术有限公司。

1.3 药物

黄芪苷，南京狄尔格医药科技有限公司，提取来源：唇形科植物黄芪的干燥根，高效液相检测纯度≥98%；注射用环磷酰胺（安道生），美国百特国际有限公司生成，进口药品注册证号：H20160467。

1.4 仪器与试剂

超净工作台（苏州苏洁净化设备有限公司），CO2培养箱（力康公司），荧光倒置显微镜（日本OLYMPUS公司），罗氏9600荧光PCR仪（美国罗氏公司），胎牛血清（杭州四季青公司），反转录试剂盒（大连宝生物工程有限公司），扩增试剂盒（上海yeasen公司），一抗（美国IMMONOWAY公司），二抗（北京中杉金桥生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 荷瘤小鼠造模

按照王红等的实验方法[4]，复苏冻存H22小鼠肝癌细胞，培养于10%胎牛血清与高糖DMEM，镜下观察，待细胞长至对数生长期时吹打成细胞悬液离心，无菌操作接种至小鼠腹腔，小鼠生长7 d后处死，无菌操作抽取腹水，离心收集细胞再重复连续体内传代两次，最后收集细胞，用灭菌生理盐水稀释洗涤，调整细胞悬液为1×107/ml，取0.2 ml接种于小鼠右腋窝皮下，制成荷瘤小鼠模型。

2.2 分组及给药

将60只小鼠随机分为模型组、环磷酰胺阳性对照组（CTX组）、黄芩苷高剂量组（黄高组）、黄芩苷中剂量组（黄中组）、黄芩苷低剂量组（黄低组）、黄芩苷中剂量联合环磷酰胺组（联合组），每组10只。各组适应性饲养一周后造模，造模第3天开始给药。模型组以10 ml/kg生理盐水灌胃；CTX组以30 mg/kg环磷酰胺腹腔注射，黄高、中、低组分别以200 mg/kg、100 mg/kg、50 mg/kg黄芩苷灌胃，联合组以100 mg/kg黄芩苷灌胃及30 mg/kg环磷酰胺腹腔注射，各组每日给药一次，连续给药14天。

2.3 检测指标

2.3.1 瘤重及抑瘤率 末次给药完毕，各组小鼠禁食不禁水、过夜，以颈椎脱臼法处死，电子天平称体重，完整剥离肿瘤组织称重，计算抑瘤率。抑瘤率=（模型组瘤重量-给药组瘤重量）÷模型组瘤重量×100%。每组5只小鼠瘤块置于液氮等待实时荧光PCR检测，其余5只小鼠瘤块以10%甲醛溶液固定。

2.3.2 MMP2和MMP9蛋白表达 各组瘤块以石蜡包埋、切片，常规脱蜡水化，3%去离子水灭活内源性酶10 min，微波修复抗原5 min，间隔重复一次；依次滴加山羊血清、一抗、二抗；滴加SABC，DAB显色，苏木素复染，梯度脱水透明后封片，光学显微镜下每张切片取5个视野采集图像，胞内棕黄色颗粒为阳性着色，图像分析软件Image J测量光密度值，光密度值除以目标分布区域的面积即平均光密度（Average Optical Density，AOD），以5个视野AOD平均值作为每张切片蛋白表达的量化指标。

2.3.3 HMGB1、MMP2和MMP9的mRNA表达 从液氮中取出瘤块，称取30 mg放入无RNA酶EP管中匀浆，加1 ml提取液静置5 min，常规低温抽提总RNA，加入DEPC水溶解，检测RNA浓度，用反转录试剂盒反转录合成cDNA。按照扩增试剂盒提供的条件，使用荧光定量PCR仪扩增。95℃、10 s预变性，95℃、10 s，60℃、20 s，40 个循环分析融解曲线，确认扩增产物特异性。基因相对表达量采用2-△△CT法分析，以模型组为对照，以β-actin基因Ct均值为内参组，目的基因相对表达量=2-△△CT。引物序列见表1。

表1 基因引物序列

2.4 统计学分析

采用数据处理软件SPSS 19.0进行统计学分析，计量资料以（±s）表示，组间均数比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有显著性。

3 结果

3.1 各组瘤重及抑瘤率比较

黄芩苷给药后H22肝癌小鼠瘤组织生长受到抑制，黄芩苷3个剂量组瘤重量减轻呈剂量依赖性。与模型组相比，黄中组、黄高组和联合组瘤重量显著性减轻（P＜0.05或P＜0.01），抑瘤率以联合组最高，结果见表2。

表2 各组瘤重和抑瘤率比较（±s）

表2 各组瘤重和抑瘤率比较（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

抑瘤率（%）0 38 65 62 50 67组别 体重（g）35.76±3.96 36.98±6.40 36.27±6.70 34.45±5.10 34.41±5.69 32.57±3.35模型组CTX组黄高组黄中组黄低组联合组瘤重（g）5.50±3.34 3.42±2.52 1.91±1.47*2.08±1.54*2.75±2.93 1.80±0.92**

3.2 各组MMP2和MMP9蛋白表达比较

与模型组相比，黄芩苷给药各组MMP2和MMP9蛋白着色较浅，为弱阳性或阴性，AOD下降（P＜0.05或 P＜0.01），结果见图 1、图 2、表 3。

图1 各组肿瘤组织MMP2免疫组化染色（×400）

图2 各组肿瘤组织MMP9免疫组化染色（×400）

表3 各组肿瘤组织MMP2和MMP9蛋白表达比较（±s）

表3 各组肿瘤组织MMP2和MMP9蛋白表达比较（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与 CTX组比较，#P＜0.05

模型组CTX组黄高组黄中组黄低组联合组组别 MMP2（AOD）0.286±0.015 0.252±0.011**0.243±0.016**0.250±0.022*0.254±0.016*0.237±0.014**#模型组CTX组黄高组黄中组黄低组联合组MMP9（AOD）0.342±0.058 0.277±0.012**0.270±0.013**0.267±0.020**0.296±0.010*0.263±0.021**

3.3 各组HMGB1、MMP2和MMP9 mRNA表达比较

与模型组相比，黄芩苷给药后小鼠肿瘤组织HMGB1、MMP2和MMP9的mRNA表达均有不同程度降低（P＜0.05或P＜0.01）；与 CTX组比较，黄高组和联合组HMGB1、MMP2、MMP9的mRNA表达变化较为明显（P＜0.01），结果见表4。

表4 各组肿瘤组织HMGB1、MMP2和MMP9的mRNA表达比较（±s）

表4 各组肿瘤组织HMGB1、MMP2和MMP9的mRNA表达比较（±s）

注：与模型组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与CTX组比较，##P ＜0.01

模型组CTX组黄高组黄中组黄低组联合组组别 MMP2（2-ΔΔCT）1.00±0.00 0.32±0.12**0.27±0.14**##0.35±0.18**0.44±0.15**##0.21±0.06**##模型组CTX组黄高组黄中组黄低组联合组HMGB1（2-ΔΔCT）1.00±0.00 0.75±0.19*0.73±0.21**##0.76±0.11**0.78±0.05**##0.63±0.12**##MMMMP9（2-ΔΔCT）1.00±0.00 0.31±0.17**##0.25±0.12**##0.48±0.22**0.54±0.13**##0.29±0.10**##

4 讨论

4.1 黄芩苷能抑制H22肝癌小鼠瘤组织生长

肝癌为常见消化系统恶性肿瘤，病死率高，中医药在防治肝癌复发、转移及改善中晚期患者症状、提高生存质量、延长生存期等方面具有明显优势，有必要选用中药材及其提取物联合治疗肝癌[5]。黄芩是我国传统中药材，现代药理实验证实，黄芩及其提取物具有保肝作用，对肝炎、肝硬化和肝癌均有一定防治效果[6]。黄芩苷（Baicalin，BC）为黄芩提取物中最重要的活性成分，体外实验表明，黄芩苷能阻断肝癌细胞周期变化、诱导癌细胞凋亡、抑制癌细胞增殖[7]。临床研究报道，原发性肝癌患者行肝动脉化疗栓塞术后连续口服黄芩苷胶囊90天，可改善症状、提高肝功能及疗效[8]。除作为中药单体抗肝癌之外，以黄芩苷为主要成分配伍的方剂也可阻断肝癌进展[9]。

本研究观察黄芩苷高、中、低剂量给药后对H22肝癌小鼠瘤组织生长情况的影响，结果显示，各剂量组瘤重量减轻，呈剂量依赖性，与环磷酰胺联合给药抑瘤作用更加显著。

4.2 黄芩苷能下调H22肝癌小鼠瘤组织HMGB1、MMP2和MMP9基因及蛋白表达

HMGB1来自迁移率族蛋白家族，是一种高度保守的染色体结合蛋白，因在电泳中有很高的迁移率而得名。HMGB1位于细胞核内，主要参与DNA复制、转录与损伤修复；损伤、感染或化疗时，转录后修饰的HMGB1可转移至细胞质，进入分泌型溶酶体，使分泌型溶酶体与细胞膜融合并出胞，在炎症和肿瘤的发生、发展中起重要作用[10]。在胃癌、结肠癌、前列腺癌和胰腺癌等恶性肿瘤中均发现HMGB1高表达，其通过结合RAGE、Toll样受体发挥多效生物学作用，促进血管生成、组织浸润和转移[11-12]。内源性HMGB1可调控肿瘤细胞内自噬，并被认为具有抗细胞凋亡的作用，抑制HMGB1表达可促进肿瘤细胞凋亡并提高化疗药物的敏感性[13]。

基质金属蛋白酶家族是一组参与基底膜及细胞外基质水解的酶，其家族重要成员Ⅳ型胶原酶在肿瘤侵袭转移过程中具有重要的水解蛋白作用[14]。Ⅳ型胶原酶包括MMP2和MMP9，MMP2、MMP9在肝癌中高表达，且MMP9与肝癌的侵袭转移关系更为密切[15]。MMP9在肝癌中的表达与瘤体大小、瘤细胞分化程度、TNM分期以及术后复发呈正相关，MMP9表达阳性患者的生存期明显短于阴性患者[16]。MMP2基因也能够促进肝癌细胞迁移，其表达水平是诊断、治疗肝癌及判断预后的重要指标[17-18]。在肝癌细胞的侵袭迁移实验中发现，HMGB1调控MMP2和MMP9的表达，且HMGB1与MMP9的表达呈正相关[19]。HMGB1与MMP9相关的可能机制为：受损细胞释放HMGB1，HMGB1与其Toll样受体结合，驱动级联反应并触发细胞中MMP9表达上调[20]；HMGB1与纤溶酶原激活物结合，激活纤维蛋白溶酶，活化的纤维蛋白溶酶可激活MMP9，增强局部蛋白水解[21]。HMGB1还通过增强ERK1/2和NF-κB途径、上调MMP2表达推动肝癌发展[22]。

研究结果显示，肿瘤组织HMGB1、MMP2和MMP9 mRNA表达下降，MMP2和MMP9蛋白表达也呈下降趋势，表明黄芩苷可能通过下调HMGB1、MMP2和MMP9表达，发挥抑制肿瘤细胞生长、侵袭的作用，具体机制有待进一步研究。