人参对IEC-6 细胞迁移多胺信号通路钙离子调控影响的研究

李婧睿，张子微，袁雨晴，陈勇廷，姜欣，石杰（通讯作者）

（1. 牡丹江医学院 第一临床医学院，黑龙江 牡丹江 157011；2. 牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011）

0 引言

肠上皮细胞（IEC-6）是具有极性的柱状上皮细胞，参与肠道的消化、吸收、分泌、免疫屏障和应激反应等，黏膜上皮内含有大量的免疫细胞和免疫分子，是机体内最大的免疫组织。IEC-6 是体内更新最快的一类细胞，对维持肠上皮的功能有重要作用。其快速更新的特性，使其成为研究细胞增殖和分化调控机制、营养素对肠上皮的作用、细胞信号转导、肠道免疫等提供了理想的体外模型。人参在远东地区是一种很有价值的草本植物，在过去的十年里在西方广受欢迎。关于人参及其成分的有益作用已有大量文献。人参的主要活性成分是人参皂苷，这是一组不同种类的甾体皂苷，具有靶向多种组织、产生一系列药理反应的能力。然而，人参皂苷活性的许多机制尚不清楚。由于人参皂苷和人参的其他成分产生的作用是不同的，并且一种人参皂苷在同一组织中引发多种作用，因此人参的整体药理学是复杂的。人参皂苷能够独立地靶向细胞膜上的多受体系统，以及激活细胞内类固醇受体，这可能解释了一些药理作用。多胺在肠上皮细胞凋亡调控中起着重要作用。本次研究以IEC-6 细胞迁移模型为基础，提出人参对IEC-6 细胞迁移多胺信号通路钙离子调控影响[1]。具体报道如下。

1 资料与方法

1.1 实验资料。选取精密称取20g 人参药材饮片，打粉，加入150 mL100%甲醇35℃，500 w 超声提取30 min，双层纱布过滤并回收滤液；残余人参药材粉末再加入150 mL+100%甲醇，相同条件超声提取30 min，回收滤液；再加入100 mL+100% 甲醇，相同条件超声提取30 min，合并3 次回收的滤液。0.22 pm 有机滤膜抽滤，得人参甲醇溶液。用手术刀划痕法研究人参对IEC-6 细胞迁移的影响，上皮整复必须要有细胞内多胺的参与，在模拟上皮整复的体外小肠上皮（IEC-6）细胞模型中，刺激细胞迁移也需要多胺的参与。多胺介导信号通路是IEC-6 细胞迁移的主要调控因素，其中钙离子是该通路的关键指标。

1.2 实验方法。流式细胞：使用流式细胞仪-CyFlow Cube6，细胞膜电位（Em）和细胞质游离钙离子浓度，荧光CV＜2%，DNA 检测CV＜1%，颗粒检测范围宽，0.1-100 um，销售商：广州吉源生物。荧光定量PCR 法：赛默飞：使用ABI 荧光定量仪（百泰克），Kvl.1、TRPC1、PLC-γ1、RhoA、Rac1、Cdc42 mRNA 表达。Western blot 法：使用Western Blot 自动分析仪（京佰乐良成科技有限公司），Kvl.l、TRPC1、PLC-γl、RhoA、Racl、Cdc42 蛋白表达。激光共聚焦显微镜：肌球蛋白II（myosinII）蛋白的表达和分布。所有实验操作，严格按照仪器说明书执行。

1.3 统计学分析。所有数据用均数士标准差（G±s），采用SPSS 17.0 统计软件分析，数据先进行方差齐性检验，然后再进行单因素的方差分析，方差齐采用LSD 法进行组间比较，方差不齐时采用Dunnett’s T3 法进行组间比较。分析人参提取物对IEC-6 细胞迁移影响的量效关系[2]。

2 结果

2.1 人参多糖中的蛋白含量。由人参多糖测定标准曲线来看，标准曲线线性关系良好（R2=0.99378），线性范围在0.00567 -0.09423 mg· mL-1。人参多糖蛋白含量2.18 mg· mL-1（共740 mL），经过sevag 方法去除蛋白后，人参中的多糖蛋白已经被大部分去除，所剩蛋白含量非常低。蛋白含量标准曲线分布情况可见图1 所示。

图1 蛋白含量标准值

图2 人参多糖经化DEAE-纤维素层析柱超纯水洗脱液吸光度值

由图2 中，能够看到人参多糖中的纤维素层比较丰富，纤维素是白色微晶形物质，不溶于水和有机溶剂。在酸或酶的作用下能水解，最终产物是葡萄糖。人的消化道中无纤维素水解酶，所以不能消化纤维素。人体不能将纤维素水解成葡萄糖，但纤维素有促进肠蠕动等作用，对人体健康有益[3]。

2.2 人参对IEC-6 细胞迁移多胺信号通路钙离子调控影响。本次研究中对多胺信号通路钙离子调控的相关指标DFMO 负荷构建了模型图，人参多糖负荷增加[Ca2+]cyt，可导到细胞内的[Ca2+]cyt 降低，并且存在显著差异（P＜0.01）。由图3和图4 提示，人参多糖促进细胞迁移与增细细胞内[Ca2+]cyt有关。具体见下图3 与图4 所示。

图3 正常对照组DFMO 负荷图

图4 人参组DFMO 负荷图

3 讨论

人参本身具有益气健脾的作用，而通过多糖蛋白含量的测定，能够更好的确定水煎煮方法的多糖得率较高。另外，研究发现人参多糖经化DEAE-5 方法对于人参的多糖分离纯化较好，但是所提取的人参多糖仍含有杂质，本研究使用纤维素层析柱超纯水洗脱的方法能够进一步纯化人参多糖，去除杂质，且纯度更高。

人体消化性溃疡病通常伴有胃十二指肠粘膜的弥漫性炎症和溃疡部位的严重局部炎症。粘膜修复的质量可能是决定溃疡是否复发的最重要因素。粘膜结构的正确修复需要上皮和结缔组织成分的平衡刺激和相互作用，以及控制这些成分的生长因子的激活[4]。大量研究显示，人参能够促进胃肠粘膜损伤修复的作用机制，而本次研究中通过科学的方法，明确人参对IEC-6 细胞迁移多胺信号通路钙离子调控影响的相关指标DFMO 负荷构建了模型图，人参多糖负荷增加[Ca2+]cyt，可导到细胞内的[Ca2+]cyt 降低，并且存在显著差异（P＜0.01）。由图3 和图4 提示，人参多糖促进细胞迁移与增细细胞内[Ca2+]cyt 有关。[Ca2+]cyt 主要来源于人体细胞内的钙储存库释放，以及细胞外[Ca2+]cyt 的内流，人参多糖能够增加IEC-6 细胞迁移过程的[Ca2+]cyt 可逆转因DFMO 负荷所致的[Ca2+]cyt 减少。在IEC-6 细胞内增加多胺，可激活钾通道，膜电位超极化也因此被增加，从而更好的提高[Ca2+]内流驱动力，进而达到增加[Ca2+]cyt 的作用。因此，人参多糖能够作为调控多胺信号通路钙离子的作用机制之一[5]。

综上所述，人参作为益气健脾中药内含的多糖能够有效调控IEC-6 细胞迁移多胺信号通路钙离子，对药物的作用靶点明确，能够为临床寻找新的治疗上皮表面损伤为特征的胃肠道病药物，提供一定的理论基础。