补阳还五汤对脑出血大鼠模型相关蛋白表达的作用

李红云 王中琳

摘要 目的：研究補阳还五汤对脑出血大鼠模型基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）、谷氨酸（Glu）及PI3K、AKT表达的作用。方法：选取90只SD大鼠，以随机抽签法分成模型组、正常对照组及补阳还五汤组。模型组与补阳还五汤组建立脑出血模型，造模后第2 d。补阳还五汤组行补阳还五汤灌胃，模型组行生理盐水灌胃，给药14 d。比较3组MMP-9、TIMP-1、Glu，脑组织PI3K、AKT以及Bcl-2、BAX蛋白表达。结果：补阳还五汤组、模型组的MMP-9、TIMP-1、Glu均高于正常对照组，且补阳还五汤组MMP-9、Glu低于模型组，而TIMP-1高于模型组（均P<0.05）;补阳还五汤组、模型组脑组织PI3K、AKT蛋白表达较正常对照组更高，补阳还五汤组脑组织PI3K、AKT蛋白表达较模型组更高（均P<0.05）;补阳还五汤组、模型组脑组织Bcl-2、BAX蛋白表达均高于模型组，补阳还五汤组脑组织Bcl-2、BAX蛋白表达较模型组更高（均P<0.05）。结论：补阳还五汤可改善脑出血大鼠MMP-9、TIMP-1、Glu，可由激活PI3K/AKT信号转导通路，调控Bcl-2、BAX表达，继而发挥保护脑组织作用。

关键词 脑出血;补阳还五汤;PI3K/AKT信号转导通路;基质金属蛋白酶-9;基质金属蛋白酶抑制剂-1;大鼠;相关蛋白;脑组织

Abstract Objective：To investigate and analyze the effects of Buyanghuanwu Decoction on the expression of matrix metalloproteinase-9（MMP-9），matrix metalloproteinase inhibitor-1（TIMP-1），glutamate（Glu），PI3K and AKT in rats with cerebral hemorrhage.Methods：A total of 90 SD rats were selected and divided into a model group，a normal control group and Buyang Huanwu Decoction group by random lottery.Rats in the model group and the Buyang Huanwu Decoction group were given the cerebral hemorrhage model.Starting from 2 d after the model，the Buyang Huanwu Decoction group was given the gavage treatment of Buyang Huanwu Decoction，while the model group was given normal saline and continuous administration for 14 d.The expression levels of MMP-9，TIMP-1，Glu，PI3K，and AKT，Bcl-2，BAX in brain tissues of the 3 groups of rats were compared.Results：The levels of MMP-9，TIMP-1 and Glu in the Buyang Huanwu Decoction group and the model group were higher than those in the normal control group，and the levels of MMP-9 and Glu in the Buyang Huanwu Decoction group were lower than those in the model group while the TIMP-1 was higher than those in the model group（all P<0.05）.The expression levels of PI3K and AKT in the brain tissues of rats in the Buyang Huanwu Decoction group and the model group were higher than those in the normal control group.PI3K、AKT protein expression levels in brain tissues of rats in Buyang Huanwu Decoction were higher than those in the model group（all P<0.05）.Bcl-2 and BAX protein expression levels in brain tissues of rats in Buyang Huanwu Decoction group were higher than those in model group（both P<0.05）.Conclusion：Buyang Huanwu Decoction can significantly improve the levels of MMP-9，TIMP-1 and Glu in rats with cerebral hemorrhage，which may further regulate the expression of Bcl-2 and BAX proteins by activating the PI3K/AKT signal transduction pathway，thereby playing a role in protecting brain tissue.

Keywords Cerebral hemorrhage; Buyang Huanwu Decoction; PI3K/AKT signal transduction pathway; Matrix metalloproteinase-9; Matrix metalloproteinase inhibitor-1; Rats; Related protein; Brain tissue

脑出血主要是指原发性脑实质出血，在所有卒中疾病中占10%～15%，且多发于基底节区[1]。该病具有发病急、死亡率高以及致残率高的特点，属于脑卒中最为严重的类型之一，其中脑出血诱发的神经元凋亡以及继发性脑水肿，在神经功能损伤过程中起着至关重要的作用[2]。而随着近年来相关研究的逐渐深入，越来越多的学者发现PI3K/AKT信号转导通路参与了细胞增殖、分化以及抑制神经细胞凋亡等过程[3]。目前，临床上已有研究报道[4]证实，神经营养因子的使用可有效激活PI3K/AKT信号转导通路，从而改善脑出血患者临床症状，但其效果并不十分理想。因此，寻找一种更加安全有效的治疗方式显得尤为重要，亦是目前临床研究的重点。补阳还五汤属于中药制剂，具有补气活血通络的功效，目前已被广泛应用于脑卒中及其后遗症的治疗过程中，且效果显著[5]。然而，关于补阳还五汤是否会对PI3K/AKT信号转导通路产生影响，临床研究较少。鉴于此，本研究通过研究补阳还五汤对脑出血大鼠模型基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）、谷氨酸（Glu）及PI3K、AKT蛋白表达的作用并予以分析，旨在明确补阳还五汤治疗脑出血的作用机制，继而为其临床应用提供更佳的理论依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取90只清洁级SD大鼠作为试验对象，均为我院实验室饲养的6～8周大鼠。

1.1.2 药物 1）补阳还五汤：生黄芪120 g，川芎、赤芍各4.5 g，干地龙、红花、桃仁各3 g，当归尾6 g。由我院药房以水煎醇沉法制备质量浓度为5.0 g/mL的提取物，保存在4 ℃恒温箱中备用。2）生理盐水（上海研生生化试剂公司）。

1.1.3 试剂与仪器 1）水合氯醛（上海生工公司，型号：A600288）;2）大鼠脑立体定向仪（北京东方德教育科技公司，型号：m155673）;3）微量注射器（北京英伟达公司，型号：Hamilton 7000）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 选取90只清洁级SD大鼠作为试验对象，将其以随机抽签法等分成模型组、正常对照组以及补阳还五汤组。其中模型组大鼠雌性16只，雄性14只;周龄6～8周，平均周龄（7.36±0.24）周;体质量91～136 g，平均体质量（110.52±19.78）g。正常对照组大鼠雌性17只，雄性13只;周龄6～8周，平均周龄（7.44±0.25）周;体质量96～135 g，平均体质量（110.50±19.72）g。补阳还五汤组大鼠雌性18只，雄性12只;周龄6～8周，平均周龄（7.40±0.26）周;体质量94～136 g，平均体质量（110.47±19.90）g。3组大鼠性别、周龄、体质量比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究已得到医院伦理委员会批准（伦理审批号：019247）。脑出血大鼠模型的建立：通过Rosenberg法完成大鼠模型制备。即首先采用10%的水合氯醛进行腹腔注射麻醉，使用剂量为400 mg/kg，并将大鼠固定在立体仪上，选择头部正中作纵行切口，剥离大鼠骨膜，保证其冠状缝与前囱暴露。选择前囱前2 mm处以及中线右侧3 mm处分别钻1 mm直径的小孔。采用微量注射器自股动脉内抽取适量的血液，在立体定向仪的帮助下，顺着钻孔垂直进针6 mm左右，缓慢注入血液80 μL，留针10 min后撤针，并对切口进行消毒缝合。

1.2.2 干预方法 正常对照组仅裸露颈总动脉与神经。补阳还五汤组从造模后第2天开始予以26 g/（kg·d）剂量补阳还五汤灌胃治疗;模型组大鼠从造模后第2天开始予以等量的生理盐水灌胃;2组均连续给药14 d。

1.2.3 检测指标与方法 比较3组大鼠MMP-9、TIMP-1、Glu水平，脑组织PI3K、AKT蛋白表达水平，脑组织Bcl-2、BAX蛋白表达水平。采用免疫组化法测定MMP-9、TIMP-1、Glu水平，具体操作按照试剂盒说明书进行，相关试剂盒具购自北京中山金桥生物技术有限公司;采用免疫组化法检测大鼠脑组织PI3K、AKT蛋白以及Bcl-2、BAX蛋白表达水平，具体操作按照试剂盒说明书进行，相关试剂盒具购自上海雅吉生物科技有限公司。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差（±s）表示，采用配对t检验;计数资料用百分比/率（%）表示，采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠MMP-9、TIMP-1、Glu水平比较 补阳还五汤组与模型组大鼠MMP-9、TIMP-1、Glu水平均高于正常对照组，且补阳还五汤组MMP-9、Glu水平低于模型组，而TIMP-1水平高于模型组（均P<0.05）。见表1。

2.2 3组大鼠脑组织PI3K、AKT蛋白表达水平比较 补阳还五汤组与模型组大鼠脑组织PI3K、AKT蛋白表达水平较正常对照组高，且补阳还五汤组大鼠脑组织PI3K、AKT蛋白表达水平较模型组高（均P<0.05）。见表2，图1。

2.3 3组大鼠脑组织Bcl-2、BAX蛋白表达水平比较 补阳还五汤组与模型组大鼠腦组织Bcl-2、BAX蛋白表达水平均高于模型组，且补阳还五汤组大鼠脑组织Bcl-2、BAX蛋白表达水平较模型组高（均P<0.05）。见表3，图2。

3 讨论

中医学认为，脑出血当属“中风”范畴，主症为突然昏扑、语言障碍、口舌歪斜以及偏身麻木等[6-8]。针对该病病因我国中医学历代医家的论述较多，其中唐宋之前多以“外风”立论，强调“内虚邪中”。唐宋之后则以“内风”立论，强调“正气之虚”“痰湿生热”以及“心火暴甚”等。清代名医王清任则提出中风乃是“气虚血瘀”所致，遂立补阳还五汤治疗偏瘫。近代医家张伯龙等则认为该病的发生主要为阴阳失调，气血逆乱，直冲犯脑[9-11]。病理机制乃是本虚标实、气血逆乱、上盛下虚致使运化失调。且现代医学证实，脑出血后血肿周围存在一个组织损伤以及水肿形成进行性加重区域，与缺血暗半带类似，该部位的脑组织病理改变可在特定时间内可逆，若能于此时间窗内予以积极有效的治疗，可促使受损的组织功能恢复[12-14]。

MMP-9的过度表达会对基底膜完整性造成破坏，进一步促进神经血管细胞的凋亡，引起出血。而TIMP-1属于基质金属蛋白酶（MMPs）内源性抑制剂，其可通过和MMP-9得催化区以1∶1的比例可逆性结合，进一步降低MMP-9的活性，发挥保护神经功能的目的。Glu属于脑缺血兴奋性中毒分子标记物之一，机体一旦发生脑出血，则会导致突出前膜去极化，进一步促使神经元释放Glu至细胞外液中，且神经胶质细胞以及神经元摄取Glu的功能可能因缺血导致的能量衰竭而促使细胞外Glu水平升高[15-17]。同时，脑缺血会引起ATP合成缺乏，从而降低了Glu灭能，导致胞外Glu含量增加，使得神经元兴奋性持续增高，大量释放Glu。形成恶性循环。本研究结果显示，补阳还五汤组与模型组大鼠MMP-9、TIMP-1、Glu水平均高于正常对照组，且补阳还五汤组MMP-9、Glu水平低于模型组，而TIMP-1水平高于模型组（均P<0.05），提示了补阳还五汤可能是通过改善脑出血模型大鼠的MMP-9、TIMP-1、Glu水平，进一步发挥保护神经细胞功能的目的。分析原因，作者认为补阳还五汤中的赤芍、桃仁、红花以及川芎具有活血化瘀的功效，而干地龙可疏通血脉，补气活血，改善大鼠的脑血流，黄芪则具有补气升阳、利水固表的功效。此外，脑出血后机体可能释放一系列具有络氨酸激酶活性受体激活的物质，从而会与P13K的调节亚基进行特异性结合，进一步激活P13K，继而促使细胞膜上的肌醇发生磷酸化，并生成第二信使[18-20]。Akt属于P13K下游的效应分子，P13K可通过与Akt的PH结构域相结合，从而促使Akt自细胞质转位到细胞膜，同时促使其构象的改变，进一步使得Akt的多个位点发生磷酸化，激活Akt。而活化的Akt可通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白，从而实现多种生长因子的调控，以此诱发细胞生长，促进细胞存活[21-23]。补阳还五汤组与模型组大鼠脑组织PI3K、AKT蛋白表达水平相较正常对照组较高，且补阳还五汤组大鼠脑组织PI3K、AKT蛋白表达水平较模型组高（均P<0.05），提示补阳还五汤可能是通过激活PI3K/AKT信号转导通路，从而发挥脑保护作用。另外，Bcl-2属于抗凋亡基因之一，而BAX属于重要的粗凋亡基因，后者的过表达会抑制前者的表达，进一步引起细胞凋亡[24-26]。而本研究结果发现：补阳还五汤组与模型组大鼠脑组织Bcl-2、BAX蛋白表达水平均高于模型组，且补阳还五汤组大鼠脑组织Bcl-2、BAX蛋白表达水平较模型组高（均P<0.05），提示补阳还五汤可能是通过增加Bcl-2蛋白的表达，同时抑制BAX蛋白的表达，从而实现抑制细胞凋亡发生，保护脑出血的作用。究其原因，作者认为可能是补阳还五汤在有效降低血脑屏障通透性的同时，激活了PI3K/AKT信号转導通路，从而促进复合物的形成，进一步增加了胞质中的Bcl-2游离状态，以此发挥抗凋亡作用[27]。

综上所述，补阳还五汤可有效改善脑出血大鼠模型MMP-9、TIMP-1、Glu水平，激活PI3K/AKT信号转导通路，进一步调控Bcl-2、BAX蛋白的表达，可能是该药治疗脑出血的重要机制之一。

参考文献

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