夏天无对新型冠状病毒肺炎的网络药理学和分子对接研究

吴晨，魏昀，葛珊，高慧琴

(甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州 730000)

新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)是由SARS-CoV-2病毒引发的传染病[1]。自2019年12月以来，病毒已在全球多个国家和地区蔓延[2-3]，感染患者的常见症状表现为发烧、咳嗽和呼吸急促等[4]。尽管在大多数情况下，患者仅表现出轻微症状[5]，但也不乏出现急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、出凝血功能障碍和多器官衰竭等重症的患者[3,6]。目前，全球病例死亡率约为1%～5%，并随病例的年龄和健康状况表现出差异。目前，世界卫生组织(WHO)已宣布COVID-19全球性大流行[2]并将其上升为国际关注的突发公共卫生事件[7]。

网络药理学是以生物信息学、系统生物学、计算机科学等多学科理论为基础，配合分子对接技术从生物学网络角度系统综合地阐释药物对疾病网络的干预与影响，揭示多分子药物协同作用于机体的关键[8]，这与中医药整体系统的治疗思想不谋而合[9]。

夏天无(Coydalisdecumbens(Thunb.)Pers.)为罂粟科植物伏生紫堇的干燥块茎。味苦、微辛，性温，具有活血活络、行气止痛、祛风除湿之功效[10]。夏天无所含成分多样[11]，研究表明，夏天无具有抗炎、抗心律失常、改善视力、提高记忆力和镇痛等作用[12-13]。通过中医药整合药理学研究平台v2.0(TCMIP v2.0)[14]检索COVID-19基因集合对应的高频中药时，发现夏天无出现在高频中药的首位。因此，本研究将借助网络药理学和分子对接技术探讨夏天无对于COVID-19的影响机制。

1 资料与方法

1.1 软件与数据库

本研究所使用在线数据库及网址(见表1)，使用的分析软件为：Cytoscape3.2.1，AutoDock Mgltools1.5.6，AutoDock Vina 1.1.2[15]和pyMOL2.2.0。

1.2 构建COVID-19疾病靶点数据库

以“Corona Virus Disease 2019”为关键词于TCMIP和 GeneCards数据库进行疾病靶点检索(截止2020年3月10日)，收集整理与 COVID-19 发病相关的靶点，下文简称“疾病靶点”，构建COVID-19疾病靶点数据库。

表1 网络药理学研究数据库

1.3 筛选夏天无的活性成分并预测作用靶点

以“夏天无”为关键词于 TCMSP 数据库检索其中药成分，根据数据库建议参考标准：生物口服利用度(Oral bioavailability，OB)≥30%和类药性(Drug-likeness，DL)≥0.18作为筛选标准[16]，汇总得到夏天无的活性成分，下文简称“活性成分”。将汇总后的活性成分通过 PubChem 转换为Canonical SMILES标准格式，并导入 Swiss Target Prediction 数据库预测夏天无活性成分的作用靶点。

1.4 构建“活性成分-重要靶点”网络

将夏天无活性成分作用靶点和COVID-19的疾病靶点通过Uniport数据库整合为统一的Uniprot ID并借助VENNY2.1进行映射，筛选夏天无活性成分可直接作用的疾病靶点，下文简称为“重要靶点”。

将活性成分和重要靶点的数据导入Cytoscape 3.2.1软件，绘制“中药-活性成分-重要靶点-疾病”网络图。本研究借助“节点自由度(Dgree)≥平均节点自由度(AverageDgree)”这一标准筛选夏天无治疗COVID-19的核心靶点和重要成分。

1.5 构建重要靶点蛋白互作网络

将重要靶点导入 STRING 数据库，在数据库内设置蛋白质种类为“Homo sapiens(人类)”、作用阈值设置为“medium confidence(中等)”、其他条件保持默认设置，构建蛋白互作(PPI)网络模型，辅助筛选核心靶点，汇总核心靶点，将作用于核心靶点数量前3名的重要成分定为核心成分。

1.6 筛选KEGG信号通路并富集GO生物过程

将夏天无作用于COVID-19的核心靶点导入 DAVID6.8 数据库Functional Annotation模块，设置导入基因格式为“OFFICAL_GENE_SYMBOL”并分析夏天无治疗COVID-19主要涉及的KEGG信号通路。借助Cytoscape3.2.1的ClueGo分析模块，选用Use Go Term Fusion功能，设置P<0.01为标准进行筛选，分析夏天无核心靶点参与的生物过程。

1.7 核心成分和SARS-CoV-2病毒蛋白靶点的对接

通过RCSB PDB数据库以“COVID-19”为关键词检索并下载Match score较高的SARS-CoV-2病毒蛋白结构COVID-19 main protease with unliganded active site(PDB ID:6y84)，以下简称为COVID-19(6y84),保存为.pdb格式。以目前临床使用的抗新型冠状肺炎药物利托那韦为参照[17]，借助ZINC数据库Substances模块检索夏天无核心成分和利托那韦的化学结构并保存为.mol2格式。通过pyMOL2.2.0去除病毒蛋白结构中的水分子和其他配体小分子后导入Mgltools1.5.6处理，通过加氢，计算电荷，合并非极性氢后保存成.pdbqt格式。同样方法处理夏天无核心成分和利托那韦的结构后保存为.pdbqt格式。设置Grid Box 大小为40×40×40个网格点，每个网格点距离0.375 nm，使用CMD命令字符运行AutoDock Vina 1.1.2进行核心成分和利托那韦小分子与病毒蛋白的对接，取打分最高的构象导入pyMOL2.2.0进行可视化分析。

2 结果

2.1 COVID-19疾病靶点数据库的构建结果

通过查询TCMIP和GeneCards数据库，将数据整合后共得到723个与 COVID-19相关的疾病靶点(截至2020年3月10日)，并将这723个疾病靶点构建为COVID-19 疾病靶点数据库。

2.2 中药活性成分的筛选及作用靶点的预测结果

以关键词“夏天无”检索TCMSP数据库，共检索到夏天无含有18个成分。根据方法1.3中数据库建议参考标准筛得夏天无含有的8个活性成分，(见表2)。将以上8个活性成分通过 PubChem 转换为Canonical SMILES标准格式(见表3)，导入 Swiss Target Prediction 数据库分析预测发现，这8个活性成分可作用于853个(400种)靶点。

表2 夏天无活性成分及相关参数

表3 夏天无活性成分Canonical SMILES标准格式表

2.3 “活性成分-重要靶点”网络的构建结果

将夏天无的活性成分作用靶点与疾病靶点映射得到75个中药活性成分可直接作用的疾病靶点，即为重要靶点(见图1)。通过Cytoscape 3.2.1软件绘制“中药-活性成分-重要靶点-疾病”网络拓扑图(见图2)，分析结果中AverageDgree=5.882，统计发现8个活性成分 Degree≥5.882，均入选重要成分，其中罂粟次碱和荷包牡丹碱并列Degree最大值=27；而重要靶点中Degree≥5.882的即为核心靶点，共5个：HTR1A, SLC6A4, CYP2D6, PIK3CA和CHRNA4，提示这5个靶点在COVID-19病程中起到关键作用。

注：两圆相交部分为重要靶点。图1 作用靶点和疾病靶点靶点映射图

注：箭头形为中药节点夏天无，三角形节点为活性成分，圆形节点为重要靶点，方形节点为疾病；由绿色到黄色再到红色，自由度逐渐升高。图2 夏天无对“中药-活性成分-重要靶点-疾病”网络拓扑图

2.4 核心靶点蛋白PPI网络的构建结果

将重要靶点导入 STRING 数据库绘制PPI网络图(见图3)，该网络共涉及到37个节点，106条线段，其中24条线段相互作用。借助Cytoscape3.2.1分析发现(见图4)，AverageDgree=8.438，其中Dgree≥8.438的核心靶点共有34个，其中以 TGFBR2和TGFB1的作用关系最为紧密。与结果2.3中核心靶点整合后，共得到核心靶点35个(见表4)。

图3 夏天无重要靶蛋白PPI网络图

图4 重要靶点PPI网络

表4 夏天无作用于COVID-19的核心靶点

2.5 KEGG信号通路的富集结果

通过DAVID数据库KEGG信号通路版块富集，共富集到与核心靶点相关的KEGG通路17条，其中P<0.05的信号通路共有11条，P<0.01的信号通路共有4条(图5)。通过分析P<0.01的重要信号通路可知，核心靶点主要涉及神经活性配体-受体相互作用信号通路(ptr04080:Neuroactive ligand-receptor interaction)、胆碱能突触抗炎信号通路(ptr04725:Cholinergic synapse)、催乳素信号通路(ptr04917:Prolactin signaling pathway)和钙离子信号通路(ptr04020:Calcium signaling pathway)。其中，最优通路为神经活性配体-受体相互作用信号通路。

图5 核心靶点 KEGG通路富集结果

2.6 GO生物过程的富集结果

将夏天无的35个核心靶点基因进行GO分析生物过程富集，共富集到53条生物过程(P<0.01)(见图6,7)，并可分为5大类(见图8)，分别为：生物碱应激反应过程(response to alkaloid)、对尼古丁的行为反应过程(behavioral response to nicotine)、血管调节过程(regulation of blood vessel diameter)、认知过程(learning)和低密度脂蛋白粒应激反应过程(response to low-density lipoprotein particle)。其中，核心靶点在生物碱应激反应生物过程中影响最大，约占55%。

图6 核心靶点GO生物过程分析结果1

图7 核心靶点GO生物过程分析结果2

2.7 核心成分和SARS-CoV-2病毒蛋白靶点的对接

因夏天无的8个活性成分都入选了重要成分，故根据其能作用于核心靶点数目的多少排序，紫罂粟次碱、PDSP1_000624、荷包牡丹碱和球紫堇碱分别作用于核心靶点19个、18个和16个，排名重要成分前3名的成分，简称核心成分。以目前临床常用的利托那韦为参照，采用 Autodock vina 1.1.2 进行分子对接，对接的参数设置及相应的计算结果见表5。当结合能小于-5.0 表示有较好结合活性，结合能分值小于-7.0 则表示具有强结合[18]，活性对接结果显示，利托那韦的结合能为-8.8 kcal/moL，紫罂粟次碱的结合能为-9.6 kcal/moL，PDSP1_000624的结合能为-9.3 kcal/moL，荷包牡丹碱的结合能为-10.1 kcal/moL，球紫堇碱的结合能为-9.3 kcal/mol。夏天无核心成分的结合能均小于-7.0，说明核心成分可与COVID-19(6y84)形成能量低、结构稳定、结合活性较高的构象，且结合效果强于利托那韦，值得进一步研究。由图8可知，利托那韦的五元硫氮环上的氮原子与COVID-19(6y84)上的THR-199位点蛋白残基形成氢键，距离为3.4；紫罂粟次碱的1,3-二恶茂上的氧原子与COVID-19(6y84)上的ARG-4位点蛋白残基形成氢键，距离为2.3 ；荷包牡丹碱的五元环酯基上的两个氧原子分别与COVID-19(6y84)上的LYS-5位点蛋白残基形成氢键，距离分别为2.5和2.7；PDSP1_000624和球紫堇碱的1,3-二恶茂上的氧原子及苯环上的羟基与COVID-19(6y84)上的LYS-5位点蛋白残基形成氢键，距离分别为2.7和2.2。

图8 核心靶点GO生物过程分类

表5 夏天无核心成分及利托那韦与COVID-19(6y84)的结合情况

图9 COVID-19(6y84)与利托那韦、紫罂粟次碱、PDSP1_000624、荷包牡丹碱和球紫堇碱分子对接示意图

3 讨论

截止到目前，我国的防疫工作已取得阶段性的胜利，但距离全面战胜COVID-19仍有很长的征程。一方面，虽然在我国本轮疫情流行高峰已经过去，但是全球其他国家仍处在疫情大爆发阶段，输入性病例仍需谨慎；另一方面，世界范围内仍然缺少针对COVID-19高效低毒的疫苗或药物。在长达2个多月的抗疫斗争中，因为我党的坚强引导和人民共同团结，坚持中西医并重，使得中医药在抗疫舞台上大展身手。以甘肃省为例，截至3月2日，甘肃省91例确诊患者中，共有89例接受了中医药治疗，中医药参与治疗率达到了97.8%，中医药参与治疗率居全国前列[19]。

通过中医辨证，已将COVID-19划为中医学“疫病”或“瘟疫”范畴，不同于狭义的伤寒和温病或时病(风温、湿温、冬温)，因患者分布地域广泛，个体差异较大，也产生了不同的看法。仝小林等[20]根据发病季节在冬季将本病归属于“寒湿(瘟)疫”的范畴，病性上属阴病，是感受寒湿疫毒而发病。刘清泉等[21]认为，武汉市的气候条件加之暖冬季节和年末寒湿天气，形成了湿邪疫疠之气致病的外在条件，属于中医“疫病”“湿瘟”的范畴，其病因属性为“湿毒之邪”致病。范逸品等[22]结合多方特点认为，本次新冠肺炎更符合寒疫特征，且“燥”邪居于主要地位。

在目前临床治疗中，夏天无并非治疗COVID-19的临床用药，但从药性角度来讲，其味苦、微辛，性温，对COVID-19的寒湿疾病属性具有纠偏的作用，符合中医“寒者热之”的用药理论；另外夏天无具有活血活络，祛风除湿之功效，与COVID-19患者的重度炎症表现相互吻合。另一方面，借助网络药理学手段对夏天无和COVID-19的已知靶点进行分析研究，从成分角度为夏天无的可能具备的疗效提供了证据。通过研究发现，夏天无的核心成分共4个，分别是紫罂粟次碱、PDSP1_000624、荷包牡丹碱和球紫堇碱，其中Degree最大的成分为紫罂粟次碱和荷包牡丹碱。紫罂粟次碱属于苄基异喹啉类生物碱，有兴奋子宫的作用；荷包牡丹碱属于异喹啉类生物碱，具有镇痛、镇静、抗癌及肠道平滑肌解痉作用[23]，并且已有报道称荷包牡丹碱对人GLC细胞、人子宫癌HeLa细胞以及KB细胞都有一定的抑制作用[24]。夏天无可作用于BDKRB2, HTR1A, PPARG和CCR1等35个核心靶点，其中，BDKRB2和HTR1A等对血管扩张具有一定促进作用[25-26]，而PPARG和CCR1等则与炎症的发生密不可分[27-28]。这些核心靶点主要作用位点涉及神经活性配体-受体相互作用信号通路、胆碱能突触抗炎信号通路、催乳素信号通路以及钙离子信号通路。通过查阅文献发现，这些靶点所在通路影响的机体反应与多数COVID-19患者在临床表现出的血液C反应蛋白(CRP)升高和血沉升高，部分重症患者的肌钙蛋白升高及炎症因子升高和少数死亡病例出现的血管内皮脱落和血栓形成相关[17]。与此同时，夏天无成分作用的核心靶点还与生物碱应激反应过程、对尼古丁的行为反应过程、血管调节过程、认知过程和低密度脂蛋白粒应激反应过程5类生物过程相关。通过分子对接发现，夏天无核心成分与COVID-19(6y84)病毒蛋白的结合能均小于-7.0，说明核心成分与COVID-19(6y84)能够形成能量低、结构稳定、结合活性较高的构象，1,3-二恶茂上的氧原子是夏天无核心成分发挥药效的关键结合位点，COVID-19(6y84)上的LYS-5蛋白残基具有极佳的结合效果，为其治疗相关疾病提供了物质成分的构象基础，也为其发挥药效提供了可能，为进一步展开药理学实验提供了参考。

本研究借助网络药理学和分子对接技术挖掘了夏天无治疗COVID-19的重要成分，预测了重要成分的作用靶点，构建了“中药-活性成分-重要靶点-疾病”网络，分析了核心靶点互作关系，筛选了 KEGG 通路和生物过程，并利用分子对接技术将夏天无和COVID-19(6y84)病毒蛋白进行对接，深入探讨了夏天无的作用机制，提示夏天无具备治疗COVID-19的成分物质基础，值得进一步研究。但是，由于网络药理学也面临着数据库查询靶点的准确性存在争议性；被查询靶点不能确定其激活或抑制作用；中药成分被检索时，只能定性不能定量等问题，而本研究仅通过数据库的检索分析来讨论夏天无的核心成分及作用机制，其结果仍需进一步实验验证。