高效液相色谱法测定游泳池水中三氯卡班、三氯生和甲基三氯生的含量

吴 飞,王 冰,陈 晨

(扬州市疾病预防控制中心,扬州225002)

游泳运动已成为各年龄段人群广泛热爱的公共娱乐和体育锻炼项目,对游泳池水进行严格的消毒杀菌,是防止各种疾病的传播,保障池水水质与游泳者健康的必要措施。三氯卡班与三氯生具有很强的广谱抗菌和消毒效果,被广泛用于纺织、日化、农业生产以及食品加工等领域产品中,起到杀菌、抑菌作用[1]。三氯卡班与三氯生因其良好的抗菌、抑菌效果存在应用于游泳池水消毒的可能,同时也会通过游泳者穿着的纺织品,使用的日化护理产品带入游泳池水中。在游泳浸泡过程中,游泳者本身直接与池水接触,既是游泳池中污染物包括病原微生物、化学污染物的释放者也是承受者。研究发现,接触过量的三氯卡班会对哺乳动物和水生生物产生慢性毒性[2]。三氯生对生物体具有显著的内分泌干扰效应,次氯酸盐和紫外照射等消毒方式会使水中的三氯生转化成毒性更强、更稳定的有机污染物,其中通过甲基化转化成甲基三氯生被认为是其最重要的转化方式之一[3-5]。《化妆品安全技术规范》(2015版)明确规定三氯生、三氯卡班作为防腐剂在化妆品中的最大允许使用浓度分别为0.3%,0.2%。

目前,国内已发布实施的三氯生、三氯卡班的标准检测方法涉及日化用品、食品接触材料等方面。文献报道的检测方法主要有气相色谱法[6]、液相色谱法[1,4,7]、气相色谱-串联质谱法[8-10]、液相色谱-串联质谱法[11-13]。但尚无同时检测三氯卡班、三氯生和甲基三氯生的方法,以及在游泳池水中的检测应用研究。气相色谱法和气相色谱-串联质谱法存在需进行衍生化处理,操作繁琐等问题;液相色谱-串联质谱法灵敏度高,可直接检测水样中的待测物,但仪器设备价格昂贵;液相色谱法方法简单,重复性好,仪器普及度高,维护成本低,适用于在基层实验室的推广应用。本工作在优化样品前处理技术的基础上,选择HLB固相萃取柱对游泳池水富集净化,建立了同时测定游泳池水中三氯卡班、三氯生和甲基三氯生的高效液相色谱分析方法,对了解三氯卡班、三氯生及甲基三氯生在游泳池水中的实际状况,保护游泳者健康具有积极的指导意义。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1290型高效液相色谱仪,配二极管阵列检测器(PAD),HLB固相萃取柱(200 mg,6 mL)。

三氯卡班、三氯生和甲基三氯生的混合标准储备溶液:1 000 mg·L－1,分别称取三氯卡班标准品、三氯生标准品和甲基三氯生标准品适量,用甲醇溶解并定容至50.0 mL,混合均匀,置于冰箱中保存。

磷酸盐缓冲溶液:称取磷酸二氢钠15.60 g,配制成 0.2 mol·L－1的磷酸二氢 钠 溶 液,用0.05 mol·L－1氢氧化钠溶液调节溶液的pH 至5.0。

甲醇和乙酸乙酯均为色谱纯;磷酸二氢钠、磷酸和氢氧化钠均为分析纯;三氯卡班标准品、三氯生标准品和甲基三氯生标准品的纯度分别为99.0%,99.5%,98.9%;试验用水为一级水。

1.2 色谱条件

PICKERING-C8色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm);柱温为30℃;流量为1.0 mL·min－1;进样量为20μL;检测波长为281 nm。流动相A为甲醇,B为水。梯度洗脱程序:0～10 min时,A为80%;10～12 min时,A由80%升至100%,保持3 min;15～17 min时,A由100%降至80%,保持5 min。

1.3 试验方法

移取游泳池水样100 mL,用1%(体积分数,下同)磷酸溶液调至pH为5.0,加入5 mL磷酸盐缓冲溶液,充分混匀,以90滴·min－1的流量经过HLB固相萃取柱(预先用6 mL甲醇、6 mL水依次活化)富集净化,负压抽干后,用15 mL乙酸乙酯洗脱,收集洗脱液,将其在30℃下氮吹至近干,用甲醇定容至1.0 mL,按色谱条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

在游泳池水样中加入三氯卡班、三氯生和甲基三氯生混合标准储备溶液500μL,按照试验方法进行测定,空白水样和加标水样的色谱图见图1。

2.2 萃取条件的选择

2.2.1 萃取方式

试验采用二氯甲烷液液萃取和固相萃取柱萃取这2种富集方式对样品进行萃取,按照色谱条件对加标量为1.0 mg·L－1的水样进行测定。结果发现:采用二氯甲烷液液萃取对样品进行萃取时,在不改变样品溶液酸度的情况下,甲基三氯生的回收率在90%以上,而三氯卡班和三氯生的回收率仅有40%～50%;当用磷酸将样品溶液的pH调至呈酸性时,三氯卡班和三氯生的回收率明显提高,但甲基三氯生的回收率降至42.7%;当用盐酸将样品溶液的pH调至呈酸性时,对三氯卡班的测定有正干扰,回收率达到142%,说明采用二氯甲烷液液萃取无法同时兼顾三氯卡班、三氯生和甲基三氯生均能得到良好的回收率;采用固相萃取柱对样品进行萃取时,通过优化试验条件,三氯卡班、三氯生和甲基三氯生均可以得到良好的回收率。因此,试验选择固相萃取柱对样品进行萃取。

图1 空白水样和加标水样的色谱图Fig.1 Chromatograms of blank water sample and spiked water sample

2.2.2 固相萃取条件

固相萃取柱在对目标物富集过程中,影响较为显著的是洗脱溶剂种类和固相萃取柱类型。试验考察了HLB固相萃取柱(200 mg,6 mL)、C18固相萃取柱(500 mg,6 mL)和C18固相萃取柱(200 mg,3 mL)等3种固相萃取柱在甲醇、乙酸乙酯、乙酸乙酯-乙腈等3种不同的洗脱溶剂条件下对三氯卡班、三氯生和甲基三氯生回收率的影响,结果见图2。

由图2可知:当样品溶液的pH为5.0时,以乙酸乙酯为洗脱溶剂时,HLB固相萃取柱(200 mg,6 mL)对三氯卡班、三氯生和甲基三氯生的萃取效果最好。试验进一步对洗脱溶剂乙酸乙酯的用量进行了考察,结果发现,当洗脱溶剂乙酸乙酯的用量为15 mL时,洗脱完全。

2.3 流动相的选择

试验考察了分别以甲醇-水溶液和乙腈-水溶液为流动相时对三氯卡班、三氯生和甲基三氯生分离效果的影响。结果发现:以甲醇-水溶液为流动相时,三氯卡班、三氯生和甲基三氯生的分离效果良好且峰形对称性好,在22 min内能够分析完成。试验选择的流动相A为甲醇,流动相B为水,梯度洗脱程序见1.2节。

图2 不同种类的洗脱溶剂对3种不同种类的固相萃取柱萃取效果的影响Fig.2 Effect of different kinds of elution solvents on extraction efficiency of 3 different kinds of SPE columns

2.4 检测波长的选择

试验利用二极管阵列检测器在190～400 nm之间进行波长扫描,在试验选择的流动相条件下三氯生和甲基三氯生均在210 nm处有最大吸收,在281 nm处也有较大吸收,同时在230 nm波长处存在一个肩峰,而三氯卡班在266 nm处有最大吸收。试验对加标水样进行测定,结果发现:在波长210,230 nm处基线噪声大,且在目标峰附近还存在杂质峰的干扰;而在266,281 nm处基线噪声小,且在目标峰附近没有杂质峰的干扰,同时在281 nm处三氯卡班的灵敏度较高。综合考虑,试验选择281 nm作为三氯卡班、三氯生和甲基三氯生的检测波长。

2.5 标准曲线和检出限

用甲醇将混合标准储备溶液逐级稀释,配制成0.025,0.05,0.10,0.20,0.50,1.0,5.0,10 mg·L－1的混合标准溶液系列,按照色谱条件进行测定,以三氯卡班、三氯生和甲基三氯生的质量浓度为横坐标,与其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明:三氯卡班、三氯生和甲基三氯生的质量浓度均在0.025～10 mg·L－1内与其峰面积之间呈线性关系,线性回归方程和相关系数见表1。以3倍信噪比计算方法的检出限(3S/N),结果见表1。

表1 线性参数和检出限Tab.1 Linearity parameters and detection limits

2.6 精密度与回收试验

按照试验方法对阴性水样进行低、中、高等3个浓度水平的加标回收试验,每个加标样品平行测定6次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表2。

表2 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表2可知:三氯卡班、三氯生和甲基三氯生的回收率为91.4%～104%,RSD为2.5%～9.3%,说明该方法的精密度良好。

本工作建立了采用高效液相色谱法测定游泳池水中三氯卡班、三氯生和甲基三氯生含量的分析方法,该方法选择性强、线性范围宽、定量准确、精密度高以及准确度好。本方法的建立对了解游泳池水中的有毒、有害物质,并对其进行筛查,可为保障游泳者、游乐者和艺术表演者的身体健康提供可靠的科学依据。