表面增强拉曼光谱技术在食品安全检测中的应用

梁营芳,周化岚,王 燕,王 锋

(上海理工大学 医疗器械与食品学院,上海200093)

随着商品产业化的快速发展,大规模的食品生产可以在短时间内迅速完成。然而在追求高效率的过程中,发生了许多食品安全事故,例如食品中含有来自非法成分的有害物质、农药兽药残留、来自机械或生物浓缩的重金属污染以及长期储存产生的毒素。在这种情况下,开发快速、可靠的检测食品安全与质量问题的方法和技术迫在眉睫。常用的测定方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、薄层色谱法(TLC)、质谱法、酶联免疫吸附试验(ELISA)等[1-3]。然而,上述测定方法均需要昂贵的仪器、训练有素的操作人员,一般在实验室中进行,但操作较为耗时,使这些方法对样品的现场检测存在巨大障碍。

表面增强拉曼光谱(SERS)是一种与纳米尺度效应相关的拉曼散射现象。一般情况下,样品的拉曼信号非常微弱。但当待测样品吸附于具有纳米量级粗糙度的金属(常用金或银)结构表面时,样品分子的拉曼信号将得到极大的增强,这就是所谓的表面增强拉曼散射现象[4]。SERS因具有灵敏度高、响应迅速以及“指纹”识别等特点,在快速检测食品污染物等方面具有巨大的应用前景[5]。本文介绍了SERS的增强机理、基底种类与联用方法以及其检测技术在重金属离子、农兽药残留、食品添加剂、非法添加物、食源性致病微生物等方面的应用。

1 SERS增强机理

目前,人们对于SERS的增强机理还没有特别清晰的认识,这主要是因为具有SERS效应的体系非常复杂,体系表面形貌和表面电子结构、光和粗糙表面的相互作用、光和分子的相互作用、分子在表面的取向、成键作用以及分子和表面的周边环境、入射光的强度、频率、偏振度和偏振方向等因素对SERS谱图的影响均比较复杂[6]。研究表明SERS增强机理主要有两种:电磁场增强机理(EM)和化学增强机理(CM)。电磁场增强机理是由吸附在粗糙金属表面的等离子体共振引起的,可使散射强度倍增至1014[7]。但是,电磁场增强机理的推导中未考虑分子的特性,因此电磁场增强对所有分子的拉曼散射的放大应当是相同的。然而,大量研究表明待测样品的SERS光谱上特征峰的相对强度与其常规拉曼光谱差别很大[4]。而化学增强机理与电磁增强机理不同,它是由金属纳米表面与待测分子之间的电荷转移引起的,其增强的量级一般为10～1 000。这两种机制同时作用,可以增加SERS的增强因子。

2 SERS基底

SERS检测技术的发展主要是由于越来越多基于纳米结构的SERS基底的出现。目前,制备SERS活性基底的材料有金属纳米材料(贵金属和过渡金属)和非金属纳米材料(半导体、石墨烯和量子点等)[8],而且随着纳米技术的进步,具有不同尺寸、形状和组成的基底被广泛应用于食品分析。SERS的增强不仅与活性纳米结构有关,还与目标分析物和底物之间的相互作用以及基片的功能化有关[9]。研究表明SERS基底可分为胶体基底和固体表面基底。胶体基底是获得SERS信号最直接的方法,但在溶液体系中,很难控制其组装和定位。相反,固体表面基片可以很好地控制热点的形成和分析物的位置,从而表现出更好的增强性和重现性[10]。食品是一个复杂多组分的体系,根据不同样品的性质选择合适的基底对于SERS检测来说是十分必要的。

2.1 胶体基底

金、银胶体是最常用的SERS基底,其颗粒直径为10～200 nm。这些金属纳米粒子制备简单、材料便宜、稳定性好,同时其SERS性能优良。金纳米溶胶的制备通常采用FRENS等[11]的方法,使用柠檬酸钠还原氯金酸来制备金纳米颗粒。其中,金纳米颗粒的粒径大小可通过柠檬酸钠的添加量来调节;银纳米溶胶则通常采用LEE等[12]的方法来制备,煮沸条件下向硝酸银溶液中加入柠檬酸钠,剧烈搅拌1 h便能得到。

由于纳米颗粒的尺寸和形状可以影响其等离子体共振吸收特性,因此合成合适的纳米粒子对于其SERS性能的优化具有重要意义。金属纳米粒子可分为两类:一类具有光滑的表面形貌,包括纳米棒、纳米线[13]等,另一类包括纳米星[14]、纳米薄片[15],具有锋利的边缘,比表面光滑的纳米粒子具有更大的电场。HUY等[16]通过银纳米粒子SERS检测三聚氰胺,结果证实SERS增强效应因子取决于银颗粒的结构形式,在几种不同类型的银纳米结构中,树莓状的银纳米粒子表现出最强的信号。但是,由于金、银纳米粒子在环境中不稳定,特别是银纳米粒子,为了克服这些缺点,研究人员通过不同材料制备了不同结构的SERS基底。2010年LI等[17]研发了壳隔离纳米粒子增强拉曼光谱,在金纳米颗粒外面包裹一层二氧化硅或三氧化二铝,超薄涂层防止纳米粒子团聚,将其与被探测材料直接接触分离,使纳米粒子符合不同的基片轮廓;SIVASHANMUGAN等[18]采用了聚焦离子束和纳米压痕的方法制备了金/银/金纳米棒和金纳米刻度阵列,研究发现优化后的该纳米阵列有较强的SERS效应,增强因子为2.15×108;YASEEN等[19]通过银包金SERS检测方法检测样品中的农药残留,Au＠Ag纳米颗粒中金核尺寸为26 nm,银壳层厚度为6 nm,表现出明显的拉曼增强,特别是Au＠Ag纳米颗粒与靶分子相连,引起了纳米颗粒聚集产生热点。研究结果表明,采用该方法可以准确识别农药(噻氯啉、丙硫磷和恶唑)的特征波数。

另一方面,由于金属纳米颗粒表面的静电排斥作用能使胶体稳定下来,液体食品样品的电荷很大程度上会影响目标物与纳米离子之间的吸附,食品样品容易影响金属胶体的pH[5]。因此,需要提高胶体底物的重现性和稳定性。

2.2 固体表面基底

在实际应用中需要储存稳定性和重现性均较强,便于携带且不易受外界环境影响的SERS基底。为克服这些问题,将纳米颗粒组装在固体衬底上制备固体SERS基底,以提高基底的稳定性和便携性[4]。不同材料与结构的基底表现出不同的特性,NGUYEN等[20]制备了3种新型基片来检测农药:石墨烯-金膜-金纳米棒(G-Au-Au NR)基片、金膜-金纳米棒(Au-Au NR)和与金纳米棒耦合的石墨烯(GAu NR),结果表明G-Au-Au NR底物能在百万分之一的水平上检测3种农药,检出限分别在5,5,9 mg·L－1左右,这表明金纳米棒和石墨烯结合制备的基板在SERS检测中具有巨大的潜力。石墨烯由于其优异的光学和电子特性被广泛应用于SERS领域。KANG等[21]综述了石墨烯相关的衬底,包括石墨烯增强拉曼散射(GERS)和石墨烯介导的拉曼散射(G-SERS)。

纳米点阵列是典型的零维(0D)纳米结构,金属纳米点的尺寸与金属材料的厚层是增强SERS的关键[10]。相比0D纳米结构,一维结构如单金属、双金属纳米棒阵列具有更强的SERS活性。常智义等[22]通过静电纺丝工艺,将修饰了β-环糊精的Au NPs聚合液制备成静电纺丝薄膜,并以此金纳米阵列薄膜作为SERS基底,以罗丹明6G作为探针分子,获得了优异的SERS效果,增强因子约为105,检测限达到10－6级以下,且基底材料的重复性较为优越。在研发二维结构的过程中,LEE等[23]通过对纳米材料的表面化学性质进行调控,制备出了3种不同排列模式的正八面体二维阵列作为SERS基底,近年来,复杂的三维纳米结构得到了很大的关注,其在三维空间能提供高密度的“热点”,ZHANG等[24]在3D Ni泡沫基板上形成氧化石墨烯(GO)纳米结构和GO＠MoS2/Au NPs纳米结构,用于SERS检测。更小更密集的Au NPs“热点”被旋转地涂覆在诸如GO＠MoS2/Au NPs纳米结构的网格上,以形成Au NPs/GO＠MoS2/Au NPs SERS基质。GO纳米网格的分支被用作均匀的纳米间隙,形成密度较高的“热点”并吸收分子,从而产生高电磁(通过FDTD模拟证实)和信号增强。王盼[25]研创了一种稳定性强的3D仿壁虎脚的纳米“触角”SERS新基底(G-SERS),并将其应用于果蔬表皮农药残留的快速、高效采集和非标记、无损检测。

此外,开发具有柔性、黏着的SERS基底也是一个热门的研究方向,柔性基材如棉花、胶带、纸张等能应用于不规则食品表面,为SERS检测提供了方便。CHEN等[26]用胶体金纳米粒子(Au NPs)对工业胶带进行表面修饰,制备出一种具有SERS活性和“黏性”的新型基材。通过简单可行的“糊状剥离法”直接提取果蔬中的农药残留,验证了SERS胶带的实用性。

相较于传统的固体表面基底,SERS芯片具有其独特优势,为SERS检测方法的重复性和可靠性提供了一个高效平台。TANG等[27]研发了磁性可移动拉曼增强检测芯片,在环境污染物的检测中,具有磁性的可移动等离子体超晶格阵列可以快速分离,利用这一技术,成功制备了一种磁性可移动的SERS芯片,并实现了孔雀石绿、福美双、敌草快、多环芳烃等农药和环境污染物分子的高灵敏度检测[28]。虽然固体表面基片的制备相对困难,但其不存在聚集问题,因此固体表面基片具有较好的稳定性、重现性和灵敏性[10]。

3 SERS与其他方法联用

SERS具有快速、无损、痕量等特点,是一种具有广泛应用前景的检测技术。但是在实际检测中,由于食品的组成比较复杂,待测样品往往含有两种或两种以上的成分,其他分子可能与目标分析物有相似的物理化学性质,产生相似的强拉曼峰,影响结果的灵敏度和准确性。而且许多生化分子由于结构复杂不能用单一的分析技术进行检测。为了解决这一困难,人们将SERS与多种技术相结合增强其检测性能,如针尖增强拉曼技术[29]、化学分离[30]、生物捕获技术[31]、比色技术[32]和基于微流体的设备[33]。这些技术的结合促进了分析化学的进步,并在各个研究领域得到了广泛的应用。

作为一项联用技术,SERS能同时获得材料的表面形貌及表面物种的光谱信息,对于实现固-气界面或固-液界面纳米尺度分辨率的原位表征具有独特的优势[34]。ZHANG等[29]利用超低温超高真空扫描隧道显微镜-TERS联用技术(STM-TERS)实现了等离子体增强拉曼散射对单个卟啉分子的化学映射。随后他们又利用非线性扫描隧道显微镜-TERS联用技术区分了相距0.3 nm的两种结构相似的卟啉分子[35]。针对化学分离技术,张旻[36]结合了分散液相微萃取(DLLME)简便、快速、廉价且环保等特点和SERS快速、高通量、痕量检测等特点,用便携试剂盒实现了DLLME-SERS联用检测水中多环芳烃芘的方法,最低检出限为0.50μg·L－1。在生物捕获技术方面,FENG等[37]将分子印迹聚合物(MIPs)与SERS相结合,建立了一种新型的MISPE-SERS化学传感器,用于测定橙汁中噻菌灵的含量,动力学和静态吸附试验验证了MIPs对噻菌灵的有效分离和富集,整个过程仅需23 min,检出限为4 mg·L－1。PARISI等[38]在微流控通道中,采用原位电偶置换的方法制备了一种集成银纳米粒子的微流控器件,用于农药如呋喃类和甲草胺的实时检测,检出限低至5 mg·L－1。

4 SERS在食品有害物质检测中的应用

SERS作为一种现代分析技术,在检测重金属残留、农兽药残留、添加剂、非法添加物、食源性致病微生物等方面有良好的应用前景。XIE等[10]、YASSEN等[5]系统地归纳了SERS在检测食品有害物质中的应用,极具参考价值。

4.1 重金属残留

重金属污染主要是铅、汞、铬、镉、锌等在水体、土壤中的残留。这些重金属具有富集性,在环境中很难降解,并会通过食物链对人体造成伤害。重金属能使人体内蛋白质或者酶失活,也能在某些器官内富集,造成急性中毒、慢性中毒等。SERS作为一项痕量检测技术在重金属检测中得到了广泛的应用,具体见表1。

汞离子是水体中常见的重金属离子,对人体的中枢神经系统造成影响。胡宝鑫等[47]用巯基丙烷磺酸钠修饰银纳米基底,通过巯基与银纳米粒子和汞离子等的特异性结合的特点,定量检测汞离子浓度,在没有干扰离子和干扰离子为镍离子等情况下,该方法具有较好的测试准确度,结果偏差小于20%。次年,ZENG等[48]将DMc T修饰的Au＠Ag纳米粒子作为SERS探针检测Hg2＋,由于Hg2＋与氮原子之间有较强的配位作用,检出限低于10－8mol·L－1。镉是重金属污染元素之一,广泛存在于化肥、土壤、饮用水中,也存在于一些果蔬中,如蘑菇等。DASARY等[49]利用高拉曼活性物质茜素染料修饰金纳米粒子,将3-巯基丙酸、2,6-吡啶二甲酸固定在纳米粒子表面,以实现镉的选择性配位,检出限可达1×10－5mg·L－1,该方法简单、快速、重复性好,具有推广潜力。铬离子对呼吸道有很强的刺激作用,经常接触易得鼻炎、支气管炎。LV等[50]通过在Fe3O4＠Au表面涂覆2～6 mm的TiO2层,有利于富集Cr(Ⅵ),检出限为5×10－8mol·L－1,该底物对于Cr(Ⅵ)的选择性优于其他共存离子。

表1 SERS在其他重金属检测中的应用Tab.1 Application of SERSin the detection of other heavy metals

4.2 农药及兽药的残留

4.2.1 农药残留

农药在现代农业中起着至关重要的作用,具有防虫治病、调节植物生长等作用。但是,过度使用或者误用农药会造成残留问题,对人体健康产生不同程度的影响。因此,为了保障农产品的质量与安全,通过SERS检测技术对果蔬作物进行快速农残检测。

农药品种按照用途可分为杀虫剂、杀菌剂、除草剂、植物生长调节剂、杀鼠剂等。2014年,ZHANG等[51]将Au＠Ag NPs作为SERS基底,然后将纳米颗粒溶胶直接涂在苹果表皮,对果皮表面的福美双和甲胺磷进行了原位同时检测,结果表明,苹果表面福美双的最低检测浓度为4.6×10－7mol·L－1,甲胺磷的最低检测浓度为4.4×10－4mol·L－1。LUO等[52]通过迭代播种法在伪纸膜(PPFs)上原位合成了金纳米粒子(Au NPs),形成了一种结构均匀、性能灵活、具有吸芯能力的新型Au NPs-APPFs,并将其作为SERS基片用于表面农药残留的检测,该方法可在苹果皮上同时检测到福美双、甲基对硫磷和孔雀绿,其中福美双的检出限为1.1 ng·cm－2。HOU等[53]采用原位SERS和液相色谱-质谱法(LC-MS)对不同时间采摘的菠菜叶片中乐果残留量进行检测。采用SERS在60～110μm深度范围内检测到大部分已经渗透的乐果,采用LC-MS测定了菠菜叶中乐果含量为0.17 ng,两种方法的结合有助于更好地理解杀虫剂在复杂生物体系中的行为。

XU等[54]通过一种新型的含金纳米粒子的SERS活性底物修饰二氧化硅膜(Au NPs＠SiO2),采用自组装的方法制备SERS传感器,再结合化学计量学方法对牛奶中2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的残留量进行了测定。基于所开发的SERS传感器,采集了牛奶中不同浓度2,4-D提取物的SERS光谱,并用偏最小二乘法(PLS)对光谱进行了分析,结果表明该光谱具有较好的稳定性,检出限为0.01μg·L－1,线性范围为10－2～106μg·L－1。

4.2.2 兽药残留

兽药处方非法添加情况复杂,一些不法商家为提高产品的产量和销量,往往会在畜牧业和水产养殖以及生产加工过程中过度添加此类物质。利用痕量、快速的SERS技术,从兽药中筛检出此类物质越来越受到重视,具体见表2。

CHEN等[64]提出了一种简便、灵敏的SERS与样品两步预处理相结合的方法,用于实际牛奶样品中青霉素G(PENG)的残留检测,结果表明在最佳检测条件下,检出限为2.54×10－9mol·L－1(等于0.8μg·kg－1),低于欧盟标准限值(4μg·kg－1),在1.0×10－8～1.0×10－3mol·L－1浓度范围内,线性关系良好。之后该课题组以银纳米粒子(Ag NPs)为底物,辅以聚合剂硫酸镁(MgSO4),检测抗生素卡本西林二钠(CBDM),该抗生素通过羧基与基底结合。当MgSO4的浓度为1×10－2,pH为6时,CBDM的增强幅度最大,检出限为0.63×10－8mol·L－1,低于欧盟规定的抗生素最大残留限量标准(1.2×10－8mol·L－1)[65]。

表2 SERS在其他农兽药物检测中的应用Tab.2 Application of SERSin the detection of other agricultural and veterinary drugs

MENG等[31]研究了一种检测水产品中土霉素(OTC)的新方法。该方法是基于DNA序列连接的金纳米粒子(分别为13 nm和80 nm)之间的拉曼热点构建的,DNA序列与OTC适配体结合,拉曼信号分子(4-MBA)在13 nm的Au NP表面进行了修饰。OTC暴露后,适体序列优先与OTC结合,并部分脱氢,其互补序列使13 nm Au NP更接近80 nm Au NP,从而提高了拉曼强度,产生了更强的“热点”。在最佳试验条件下,SERS信号与OTC浓度在4.6×10－2～4.6×102fg·mL－1范围内呈正相关,检出限为4.35×10－3fg·mL－1。该方法具有较高选择性,为多种传感应用提供了一种很有前途的策略。

4.3 食品添加剂

目前,食品添加剂已成为食品生产加工过程中必不可少的物质。其按照功能可分为着色剂、防腐剂、抗氧化剂、甜味剂等,用于改善食品色、香、味等品质以及用于食品防腐。但是,滥用或者超过规定的剂量使用添加剂会造成食品的质量安全问题。

AI等[63]在聚乙烯吡咯烷酮(PVP)表面活性剂存在下,用抗坏血酸还原硝酸银,合成花状银纳米粒子,检测4种不同的食品着色剂(食品蓝、石杉碱、日落黄、酸性红),检出限分别为 79.285,5.3436,45.238,50.244μg·L－1。YAO 等[66]在2012年使用金溶胶作为活性基底检测了2,6-二叔丁基对甲酚(BHT),检测限可达10 mg·L－1。之后该课题组等合成了用于敏感、快速、方便、无损检测的核壳纳米材料,选择最佳合成条件进行半定量检测。通过SERS筛选,检测了黄鱼、红烧肉、红辣椒、青饺、红酒中的酸橙II和亮蓝。结果与标准高效液相色谱法比较,验证了SERS的正确性,以及核壳纳米粒子在快速检测食品中的色素方面具有良好的性能[67]。

WANG等[68]以ZnO＠Ag空心纳米球为模型,研制了一种用于测定食品中亚硝酸盐的SERS传感器。该传感器4-氨基噻吩醇(4-ATP)和1-萘胺(1-NA)的相互作用,使ZnO＠Ag空心纳米球基片表面的亚硝酸根有明显的增强作用。在优化的试验条件下,亚硝酸盐检测的线性范围为1×10－8～1×10－3mol·L－1,检出限为0.3×10－8mol·L－1,该SERS基底的增强因子为3.17×108。

4.4 食品非法添加物

食品非法添加物并非可食用添加剂,而是危害性未知或者因毒性较大而被禁止的化学合成物[69],如三聚氰胺、吊白块等。随着食品工业的发展,一些不法商家为谋取私利在食品中加入非法添加物,损害了人体健康,影响社会安定。因此,建立一种快速灵敏的检测方法对于食品工业健康发展十分重要。

CREEDON等[70]介绍了在柔性热塑性聚合物表面模板化纳米结构,用铝苏打罐模板制备透明表面增强拉曼散射基片,再在表面沉积银的方法,检测牛奶和婴儿配方奶粉中的三聚氰胺。检测结果同商用串联质谱仪(MS-MS)相对比,具有相似灵敏度。YU等[30]将磁性纳米粒子与磁性固相微萃取(SPME)装置相结合,提出了分散磁性微萃取-SERS检测方法,实现了富集、磁分离、检测一体化,用以检测保健酒中枸橼酸西地那非(SC)含量,检出限为1.0×10－8mol·L－1,从富集到检测只需10 min。

4.5 食源性致病微生物

世界卫生组织将食物传播疾病定义为由通过摄入食物进入人体的病原体引起的疾病,通常是传染性疾病或有毒疾病[71]。常见的食源性致病微生物有沙门氏菌、金黄色葡萄杆菌、大肠杆菌O157:H7、李斯特菌、芽孢杆菌以及一些病毒。传统的微生物检测方法较为费时,无法达到快速检测的目的。SERS技术高效、灵敏,在快速检测食源性微生物中具有良好应用前景。

ZHANG等[72]通过在聚甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯(POEGMA)刷中加入多层银纳米粒子(Ag-NPs),利用堆垛法探索三维(3D)SERS基底的制备方法,检测金黄色葡萄球菌,检出限为8 CFU·mL－1。BOZKURT等[73]建立了一种利用碱性磷酸酶(ALP)酶活性检测大肠杆菌(E.coli)的夹心免疫分析方法,同时合成了球形磁性包金核壳纳米颗粒(MNPs-Au)和棒状金纳米颗粒(Au NRs),并对其进行了改性,检出限为10 CFU·mL－1。

LIAO等[74]提出了一种基于三维SERS和激光诱导击穿光谱(LIBS)相结合的细菌定性定量检测方法。采用改进的原位合成方法制备了SERS活性Ag NPs,并通过原位合成样品液滴的自然蒸发获得了细菌的可重复SERS光谱。整个检测过程,包括样品制备和检测,可在约30 min内完成,分析时间短,操作简单,所提出的策略显示了细菌分析的巨大潜力。

5 结论与展望

SERS作为一种快速、灵敏的检测技术,在检测重金属污染、农兽药残留、滥用食品添加剂、食源性致病微生物等方面起着重要的作用。但是,目前SERS技术在食品安全检测的实际应用中仍处于起步阶段,在理论分析、定量分析方面也面临着相应的挑战。

第一,对于SERS机理的解释尚未达到清晰的地步,对某些SERS现象也无法进行充分解释。电磁场增强机理和化学增强机理是目前主要的两种理论支撑,但尚未得到一致认同。因此,对SERS的理论研究还需不断进行。

第二,虽然SERS基底的制备材料与方法多种多样,但仍然面临着不稳定、重现性差、成本高、结构不均匀等问题。复杂的二维或三维纳米结构能产生较多“热点”,但它们很少应用于食品安全分析中,未来可以在这方面进行深一步的研究。

第三,由于同一待测样品在不同试验条件下,其信号强度会有差异,因此将SERS应用于定量分析仍然是一个挑战。通过将化学计量学方法和光谱数据分析相结合,以及拉曼光谱仪器和纳米基底的发展,SERS定量分析方面有了一定的进展,但是在定量的精度方面仍需继续研究。

第四,不同样品的迅速测定需要建立一个统一的拉曼光谱谱图库。但由于SERS信号的强度受检测环境、基底等因素影响,因此建立该图库还需要做大量的工作。

第五,目前SERS研究仅侧重于少量有害物质,对于无机有害物质的研究较少。同时,对于样品的选择也比较单一,例如农药的样品往往是果汁、水果,很少研究小麦等农作物。

总之,作为一种新兴的分析检测技术,SERS技术在食品安全检测领域展现出极大的潜力。在未来,SERS技术可以通过技术联用提高检测的灵敏性,如与化学分离技术、生物捕获技术等。在现场检测方面,为了快速、便捷的获取结果,可致力于开发便携式拉曼光谱仪,该方法应用于现场快速检测具有广阔的前景。