应用超临界流体萃取分离-气相色谱-质谱分析法建立中药温郁金的指纹图谱及其系统聚类分析

王 聪,谢 磊,董雪瑞,杨雨萱,郑思跃

(杭州职业技术学院 临江学院,杭州310018)

温郁金[1]又名温莪术、黑郁金,为姜黄属郁金的栽培品种。将温郁金的块根洗净,上笼蒸后晒干,即为温郁金;根茎洗净后,除去须根及糙皮,蒸熟后晒干为温莪术;将根茎洗净后,用刀纵切成薄片,直接晒干为片姜黄。温郁金是一种可加工成3种中药饮片的药材,其主产区为浙江瑞安,气微香,味微苦,具有活血止痛,行气解郁,清心凉血,利胆退黄功效。根茎挥发性成分主要为倍半萜醇和倍半萜烯等活性物质[2-3]。现代药理研究表明,温郁金具有良好的抗癌作用,对于癌症研究具有很大的贡献[4-5]。

中药整体质量标准体系应该建立在中药指纹学体系的基础上,中药指纹学体系是一种以整体性、特征性、稳健性、有效性和安全性为核心的研究中药的全新学科体系。中药指纹信息学为核心处理技术和关键方法,是揭示中药指纹所表达的化学物质信息、生物活性与药效信息、药代动力学和药剂学信息以及相关测试技术条件与方法等综合信息的科学。中药整体质量标准体系的出发点要立足于中药指纹学的思路和方法,从全新视角控制中药质量[6]。温郁金为“浙八味”之一,具有较强的地域属性,有关温郁金指纹图谱研究报道中,大多采用高效液相色谱法[7-9]、气相色谱法[10-12]和光谱法[13-14]等分析方法,均为温郁金的质量评价提供了较好的参考。但其采用的前处理方法,如水蒸气蒸馏法、浸泡法、超声溶剂萃取法等,均存在过程复杂、损失较大、受基质影响等问题。

超临界流体是指温度、压力均高于自身临界状态的流体,其黏度和扩散系数与气体相接近,而密度和溶剂化能力却与液体相接近。超临界流体萃取技术(SFE)为国际上最先进的物理萃取技术,能最大限度保持天然产物的活性,提高产物的提取率与产品的纯度,具有安全无毒副作用、操作简单、省时等优点,该技术在天然产物加工中的应用日益广泛。系统聚类的基本思想是将n个样品或变量看成n个分类,然后将距离接近(样品聚类)或性质接近(变量聚类)的两类合并为一类,再从n－1类中继续寻找最接近的两类合并一类,如此继续,最终将所有类别合并为一支[15]。笔者已经应用SPSS软件系统聚类分析比较了不同产地铁皮石斛的裂解气相指纹图谱[16]和不同产地菊花的顶空-固相微萃取-气相色谱(HS-SPME-GC)指纹图谱[17]。钱华丽等[18]采用SFE萃取温郁金中的挥发性成分,优化萃取条件为55℃、35 MPa、240 min,并采用气相色谱-质谱法(GC-MS)对挥发性成分进行定性及半定量分析,与水蒸气蒸馏工艺相比,SFE的回收率较之高出3倍,萃取时间缩短4倍,抗癌有效活性成分含量更高。与此文献比较,本工作在SFE萃取过程中具有较多优势:采用的样品量更少,只需要30 g,而文献中需要300 g样品量;采用了动-静态联合萃取法,物料在CO2中能够更充分的浸润,气流的方向多样化同时也更节约气流,总萃取时间(静态萃取时间30 min和动态萃取时间90 min)为120 min,时间更少。采用正交试验对SFE萃取条件进行优化,优化的条件略有不同,这与采用的仪器密切相关。本工作收集了14批温郁金样品,采用SFE-GC-MS建立了其指纹图谱,指认其特征峰,总离子流色谱图与NIST 14谱库比对,并结合相关文献对共有峰进行定性,采用系统聚类分析法对不同产地的14批温郁金的SFE-GC-MS指纹图谱进行分类比较,最后利用指纹图谱对2个市售温郁金产品进行产地鉴别和质量评价。

1 试验部分

1.1 仪器与材料

7890A/5975C型气相色谱-串联质谱仪;7890A型气相色谱仪,配氢火焰离子化检测器(FID);SFE-2ASI型超临界萃取仪;CP 224S型分析天平;SRA10N-50型冻干机;FW 177型中草药粉碎机;SPSS 16.0统计分析软件。

14批温郁金样品均由某温郁金合作社提供,具体信息见表1。从药材市场购买2批温郁金样品(U1、U2)作为待测样品。

1.2 仪器工作条件

1)色谱条件 HP-5ms石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25μm);进样口温度为280℃;不分流进样;载气为氦气,流量为1.0 mL·min－1。柱升温程序:初始温度为50℃;以15℃·min－1的速率升温至155℃,保持1 min;再以2℃·min－1的速率升温至220℃,保持5 min。

表1 温郁金样品信息Tab.1 Information of the wenyujin samples

2)质谱条件 电子轰击离子源(EI),电离能量为70 eV;离子源温度为230℃;质荷比(m/z)扫描范围50～650;传输线温度为280℃。

1.3 试验方法

将温郁金洗净、沥水后冷冻干燥36 h,用研钵磨碎,用中药网筛筛取颗粒直径小于0.425 mm的粉末样品。称取样品30 g于10 mL萃取釜内,将萃取釜置于加热箱内,连接萃取釜接口,关上箱门。调节萃取温度为35℃,温度达到设定值时,设定压力为15 MPa。当温度和压力均到达设定值时,进行静态萃取并开始同步计时(注意要关闭出口阀),静态萃取时间为30 min。静态萃取结束,同时进行动态萃取,回收萃取液。在回收瓶内加入5 mL甲醇,并将出口针没入甲醇中。打开出口阀,调节微量阀,设置CO2气体流量为800 mL·min－1,开始动态回收萃取液。气动泵可将萃取釜内压力保持在设定值区间内,动态萃取时间为40 min。按照仪器工作条件进行测定,计算温郁金精油得率,具体见公式(1):

式中:w为温郁金精油得率;m2为精油的质量,g;m1为温郁金的质量,g。

2 结果与讨论

2.1 正交试验

分别对萃取温度(A)、萃取压力(B)、静态萃取时间(C)、动态萃取时间(D)进行单因素试验,以温郁金精油得率为考察指标,采用L9(34)正交试验表,对萃取温度(30,35,40℃)、萃取压力(10,15,20 MPa)、静态萃取时间(20,30,40 min)、动态萃取时间(60,90,120 min)等4个因素在3个不同水平上按照L9(34)进行正交试验,结果见表2。

表2 正交试验结果Tab.2 Results of the orthogonal test

由表2可知:各因素对超临界CO2萃取温郁金中的精油得率的影响顺序为:萃取温度＞动态萃取时间＞萃取压力＞静态萃取时间。最佳萃取条件为A2B2C2D2,即萃取温度为35℃,萃取压力为15 MPa,静态萃取时间30 min,动态萃取时间90 min。

采用最优条件平行萃取5次,温郁金精油得率平均值为1.29%,该值均高于以上表2中的精油得率,由此验证萃取条件的可靠性。

2.2 色谱行为

2.2.1 温郁金指纹图谱的参照峰与共有峰的选择

按照试验方法对14批温郁金样品进行测定,S3样品的色谱图见图1。

由图1可知:温郁金CO2超临界萃取经GCMS分析后,总离子流色谱图中共有50多个色谱峰,选择共有峰作为考察对象,即保留时间在40 min内的1～26号色谱峰。14批样品的共有峰面积分别占总峰面积的85%左右,选择保留时间为17.12 min的16号峰为参考峰,该峰为温郁金有效成分莪术二酮、峰强度最强且稳定。

2.2.2 温郁金指纹图谱的建立

根据14批温郁金样品的色谱图计算26个共有峰的相对保留时间α(各组分的调整保留时间与峰16的调整保留时间的比值)和峰面积百分比S(该组分峰面积占共有峰面积之和的百分比),以及各样品中26组分的峰面积百分比S之间的最大差值[ΔS(Max)],结果见表3。

由表3可知:当α为0.296～3.342时,S＜10%,ΔS(Max)为0.17%～7.96%,按照文献[19]要求,当S＜10%时,对ΔS(Max)不作要求。以上的结果表明:14批温郁金样品的SFE-GC-MS的图谱具有较强的相似性,完全达到建立指纹图谱的技术要求。

图1 S3温郁金样品的总离子流色谱图Fig.1 Total ion current chromatogram of S3 wenyujin sample

表3 14批温郁金样品的SFE-GC-MS指纹图谱数据Tab.3 SFE-GC-MS fingerprint data of 14 wenyujin samples

2.2.3 温郁金化学成分的质谱分析

结合文献[10-11,18,20]以及NIST 14谱库质谱分析可知,超临界萃取温郁金所得挥发油基本上为倍半萜烯烃及其氧化衍生化合物。图1和表3中的峰5、7、13～18为温郁金中标志性挥发性产物,在抗肿瘤、抗病毒方面发挥重要作用;峰1～3为单萜类化合物,具有抗氧化、抗菌、祛痰等作用;峰4、6、8～12均为倍半萜类化合物,此类物质具有芳香性,气味浓郁;峰19～24为倍半萜的氧化衍生物,具有芳香性、抗炎性等作用;峰25、26均为脂肪酸。

2.3 温郁金样品的系统聚类分析

采用SPSS 16.0软件包中的系统聚类程序对16(14批样品及2个市售温郁金待测样品)×26阶(26个共有峰的相对峰面积)原始数据矩阵进行分析。方法上,数据进行标准化从－1到1,采用平方欧式距离作为间距测量变量,样本间以组间联接聚类法进行连接,输出系统聚类谱系图。

图2为温郁金样品系统聚类谱系图,横坐标为临界值,即类间距离,纵坐标为样品来源地。临界值越小,表示色谱图相似度越高。

图2 温郁金样品系统聚类谱系图Fig.2 Hierarchical cluster analysis diagram of curcuma wenyujin samples

由图2可知:当临界值为9～10时,来源于瑞安市陶山、瑞安市马屿、瑞安市南滨分为3类,反映了这3类温郁金的不同产地来源,瑞安市陶山镇位于经度120°39′,纬度27°47′,瑞安市马屿经度120°27′,纬度27°47′,瑞安市南滨经度120°39′,纬度27°42′。产地的地理位置非常接近,因此受到当年的光照、雨水、温度等方面影响较少,主要受土壤条件和人工种植方式影响较大;当临界值为4～9时,来源于瑞安市陶山镇沙一村(S1、S2)、二村(S3、S4)、三村(S5、S6)与瑞安市陶山镇岱下村(S9、S10)、瑞安市陶山镇楼渡(S14)分为3类,反映了瑞安市陶山镇温郁金与其他地方的差别;当临界值为1～4时,各个产地的温郁金均能得到清晰的区分;另外,2个市售温郁金样品U1和U2,经此相同系统聚类分析法,可判定为样品U1产地为瑞安市陶山镇沙二村,样品U2产地为瑞安市马屿青垟。结果表明,即使是地域非常接近,系统聚类分析法也能较为全面、综合地反映不同产地温郁金SFE-GC-MS谱图之间的差异,还能对市售温郁金样品进行产地鉴别。

本工作建立了SFE-GC-MS分析8个产地14批温郁金样品和2个市售温郁金样品的气相色谱指纹图谱,后进行系统聚类分析。结果表明,建立的方法既能反映温郁金SFE-GC-MS图谱之间的相似关系又能反映不同产地的差异,并可对市售温郁金进行产地鉴别。