共固定化复合酶澄清刺梨汁工艺的优化

安玉红， 陆敏涛， 黎代余 ， 黄 燕 ， 彭永贤

(1.毕节职业技术学院， 贵州 毕节 551700； 2.贵州大学 酿酒与食品工程学院， 贵州 贵阳550025)

刺梨(Rosaroxbunghii)为蔷薇科(Rosaceae)多年生落叶灌木缫丝花的营养珍果，是我国贵州、云南、四川等西部山区特有的野生植物，其中以贵州最多，全省除威宁县尚未发现刺梨外，其他各区县均有分布[1]。目前，贵州省刺梨栽培面积已在330万hm2以上，全省鲜果年产量1 500万kg以上，居全国之首[2]，刺梨已成为贵州省重点发展的特色产业之一。刺梨是集食用、药用、保健和观赏为一体的绿色特新水果[3]，其果汁中富含大量维生素、植物多糖、单宁类、三萜皂苷类、黄酮类、生物碱类、有机酸类、蛋白质和矿物质等活性成分[4-8]，且无急性、慢性毒性，可长期安全食用[9]。

目前，市场上的刺梨产品主要有刺梨汁、刺梨饮料、刺梨果干、果脯和果酒等[10]。其中，刺梨汁因其具有抗氧化[11-13]、解酒护肝[9]和降血糖血脂[14-16]等功效，越来越受人们青昧。但刺梨汁在贮藏过程中极易产生褐变和絮状浑浊物等现象，影响商品性状，严重限制刺梨产业的发展。目前，已报道的刺梨汁澄清方法有机械澄清法[17]、自然澄清法[18]、超滤澄清法[19]、JA澄清法[20]和甲壳素类法[21]等，贵州省刺梨汁加工的澄清方法主要采用明胶单宁法或壳聚糖单宁法，该方法操作简单，既能脱涩，还具有很好的澄清效果，但需静置20 h以上，在此过程中刺梨汁褐变严重、安全风险增加、营养损失大、设备利用率低、不可连续化生产[21]。生物技术或酶工程技术因其作用条件温和、时间短、操作性强，广泛应用于果汁、果酒和饮料[22-23]等澄清处理中。而直接使用游离酶制剂存在成本较高和回收难等问题，随着酶工程的逐步成长，固定化酶在一定水平上填补了这一缺陷[24]。以壳聚糖为载体制得的固定化酶，化学稳定性高，机械性能好且容易回收，壳聚糖作为自然阳离子澄清剂，可以和果浆中蛋白质、果胶和纤维素等带负电荷物质互相作用[25-26]。果胶酶大致分为果胶裂解酶 (pentinlyases, PL)、果胶水解酶(pectinhydrolases)、果胶酯酶(pectinesterases, PE)和原果胶酶等。果胶水解酶又分为聚半乳糖醛酸甲酯水解酶(polymethylgalacturonases, PMG)、聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase, PG)等。其中PL只能裂解贴近甲酯基的α-1,4糖苷键，而PG降解果胶为小分子，并使其还原末端暴露[27]。由于不同的果品蔬菜其果胶含量、成分差异较大。因此，在使用时应根据加工目的、品种来选择果胶酶的酶组成。因PG的专一性对果胶的酯化度要求不如PL高，在提高榨汁率时通常选用PL，在澄清果汁时以PG为主。果纤维素酶不仅能提高果蔬的出汁率和可溶性固形物含量，而且能改善部分果蔬汁的品质[28]。谌国莲等[29]研究表明，果胶酶、纤维素酶等酶联合使用，显著提高荔枝澄清度、稳定性和果汁品质。目前，鲜见果胶酶和纤维素酶联合使用刺梨汁的报道，因此，研究共固定化果胶酶和纤维素酶对刺梨汁的澄清效果，以期为生产高品质的刺梨汁提供参考。

1材料与方法

1.1材料

刺梨汁：由贵州奇昂生物科技有限公司提供。

试剂：果胶酶(酶活力10 U/g)，河南万邦实业有限公司。羧甲基纤维素钠(CR)，国药集团；果胶﹝半乳糖醛酸(干基计) ≥74.0 %〕，广州万邦有限公司。纤维素酶(酶活力10 U/g)，河南万邦实业有限公司；壳聚糖(脱乙酰度90%)，上海伯奥生物科技有限公司；SOD试剂盒，南京建成生物工程研究所；试验用其他试剂，均为分析纯。

仪器与设备：H1-16KR高速冷冻离心机，湖南可成仪器设备有限公司；R-201旋转蒸发器，上海申胜生物技术有限公司；YP 3001 N电子分析天平，上海精密科学仪器有限公司；DY89-II电动玻璃匀浆机，宁波新芝生物科技股份有限公司；RYC-111恒温摇床，上海福玛实验设备有限公司；L5S紫外-可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；手持糖度仪，上海勃基仪器仪表有限公司。

1.2方法

1.2.1壳聚糖共固定化复合酶的制备参考文献[30-32]的方法进行，准确称取壳聚糖10 g，用1%乙酸充分溶解后，并用1%乙酸定溶至500 mL，静置2 h。用5 mL注射器逐滴加入到溶于1 000 mL 1 %乙酸溶液中，经磁力搅拌器充分搅拌，溶解后静置到气泡消失。将上述溶液用5 mL的注射器逐滴加入到1 250 mL混合液(10% NaOH与95%乙醇，体积比为4∶1)中，并在4 ℃条件下放置12 h后，滴入少许5%戊二醛，搅拌后静置6 h。抽滤，蒸馏水洗涤至中性，用吸水纸吸干表面水分，加入纤维素酶和果胶酶的酶液，摇床振荡固定化(4℃，6 h)后，用蒸馏水洗去未固定的酶，再抽干即得固定化复合酶，收集微球，于4℃冰箱保存备用。

1.2.2刺梨汁透光率最佳波长的测定量取少量已加入固定化复合酶(果胶酶∶纤维素酶=3∶1)的刺梨汁，分别在波长为50 nm、500 nm、550 nm、600 nm、650 nm、700 nm、750 nm和800 nm下，用分光光度法，测定刺梨汁的吸光度，用最佳波长处的透光率(T，%)表示刺梨汁的澄清度[30]。

1.2.3单因素试验

1) 复合酶比例筛选。量取1 000 mL刺梨汁，加入质量比例分别为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1和5∶1的果胶酶和纤维素酶制备壳聚糖固定化复合酶微球，在50℃水浴下反应60 min，测其透光率。

2) 共固定化复合酶的添加量。量取1 000 mL刺梨汁，加入果胶酶∶纤维素酶为 3∶1的壳聚糖固定化果胶酶和纤维酶的微球，添加量分别为5 g/L、10 g/L、20 g/L、30 g/L和40 g/L，在50℃水浴下反应60 min，测其透光率。

3) 酶解时间。量取1 000 g/L刺梨汁，加入果胶酶∶纤维素酶为3∶1的壳聚糖固定化果胶酶和纤维酶的微球，添加量为20 g/L，在50℃水浴下反应40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min和100 min后，分别测其透光率。

4) 酶解温度。量取1 000 mL刺梨汁，加入果胶酶∶纤维素酶为3∶1的壳聚糖固定化果胶酶和纤维酶的微球，添加量为20 g/L，在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃和65℃水浴下反应70 min后，分别测其透光率。

1.2.4正交试验在单因素试验基础上，针对加酶量、酶解时间、酶解温度 3个因素，进行3因素3水平的L9(43)正交试验设计(表1)，以确定固定化最优条件。

表1 共固定化复合酶澄清刺梨汁的正交试验因素及水平

Table 1 Factor and level of orthogonal test for clarifyingR.roxbunghiijuice by co-immobilized complex enzyme

因素Factor加酶量(A)/(g/L)Enzyme amount酶解时间(B)/minEnzymolysis time酶解温度(C)/℃Enzymolysis temperature110655022070553307560

1.2.5刺梨汁澄清前后营养成分的测定多酚的测定采用Folin-Ciocalteau法进行测定[33]；总黄酮采用硝酸铝—醋酸钾法[34]；VC采用钼蓝比色法分析[35]；SOD采用羟胺法，具体步骤参见试剂盒。

1.2.6共固定化复合酶的稳定性试验将共固定化复合酶进行连继10次重复使用，并测定每次的刺梨汁透光率。

1.3数据处理

试验结果以 平均值±标准差表示，各组间差异显著性采用 SPSS 22.0分析，各组间比较采用单因素方差分析，用Duncan法分析显著性。

2结果与分析

2.1刺梨汁透光率的最佳波长

由图1可知，随着波长的增加，刺梨汁透光率先增加后保持不变，其中650 nm时其透光率为77.12%，之后其透光率基本保持不变，所以确定刺梨汁透光率最佳波长为650 nm。

2.2不同因素对刺梨汁透光率的影响

从图2可知，不同果胶酶与纤维素酶比例、固定化复合酶添加量、酶解温度和酶解时间对刺梨汁透光率有不同的影响。

2.2.1果胶酶和纤维素酶比例随着果胶酶与纤维素酶比例的增加，刺梨汁的透光率呈先增后减趋势，其中果胶酶∶纤维素酶为3∶1时，刺梨汁的透光率显著高于其他比例；当其质量比为4∶1和5∶1时，刺梨汁的透光率减小。可能因为果胶酶质量浓度增加时，抑制了纤维素酶的活性，导致透光率降低。故果胶酶∶纤维素酶宜为3∶1。

图1 刺梨汁透光率与波长的关系

Fig.1 Relationship between light transmittance and wavelength ofR.roxbunghiijuice

注：不同小写不同表示差异显著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters indicate significance of difference atP<0.05 level.

图2 不同因素下刺梨汁的透光率变化

Fig.2 Variation in light transmittance ofR.roxbunghiijuice under different factors

2.2.2固定化复合酶添加量随着固定化复合酶添加量的增加，刺梨汁的透光率呈先增后降趋势，当添加量为20 g/L时，其透光率最高，为78.09%。可能是复合酶添加量的增加，水解完相应底物后，未反应完全的酶影响其透光率。

2.2.3酶解温度随着温度的升高，刺梨汁的透光率呈先增后降趋势，在50℃时，刺梨汁的透光率达80.04%；在50℃后，刺梨汁的透光率随着温度的升高而降低。可能与果胶酶和纤维素酶的最适温度有关，温度过高或过低，均影响酶的活性。

2.3.4酶解时间随着酶解处理时间的延长，刺梨汁的透光率呈先增后降趋势，处理70 min时的透光率最高，为78.55%。这是因为刺梨汁中虽含VC含量高，但多酚类物质含量也非常丰富，在50℃水浴中进行酶解，其氧化速度会加快，当酶解时间超过70 min后，底物基本完全酶解，与多酚类物质竞争氧分子的底物减少，使其酶促褐变加快，影响刺梨汁的透光率。

2.3共固定化复合酶澄清刺梨汁的工艺优化

由表2可知，不同因素对固定化果胶酶和纤维素酶澄清刺梨汁影响的顺序为C>A>B；其最优水平为A2B2C2。正交试验方差分析表明，加酶量、酶解时间和酶解温度皆可显著影响固定化果胶酶和纤维素酶对刺梨汁澄清的作用。共固定化复合酶澄清刺梨汁的最佳工艺为果胶酶与纤维素酶的质量比3∶1、酶添加量为20 g/L，酶解时间70 min，酶解温度55℃，在该条件下，刺梨汁透光率可达86.45%。

表2 共固定化复合酶澄清刺梨汁正交试验各处理的透光率

Table 2 Light transmittance ofR.roxbunghiijuice clarified by co-immobilized complex enzyme

处理Treatment加酶量(A)/(g/L)Enzyme amount酶解时间(B)/minEnzymolysis time酶解温度(C)/℃Enzymolysis temperature111121223133421252236231731383219332K1208.44211.09188.69K2230.36227.33237.33K3203.42203.80216.20k169.4870.3662.90k276.7975.7879.11k367.8167.9372.07R8.987.8416.21优水平 A2B2C2 Optimum level

2.4处理前后刺梨汁功能性成分含量

由表3可知，壳聚糖固定化复合酶澄清刺梨汁对其主要营养物质的影响各有差异，导致刺梨汁混浊的多酚、水溶性蛋白质含量显著(P<0.05)下降，分别下降14.32%和11.57%，这是因为多数水溶性蛋白质和少数酚类物质会随壳聚糖的絮凝性能和果胶酶及纤维素酶的分化功能而沉降[37]。刺梨汁中VC、SOD和总黄酮含量有下降趋势，但差异不显著(P>0.05)，分别下降5.01%、6.13%和7.23%。说明壳聚糖固定化果胶酶及纤维素酶澄清能较好地保存刺梨汁中的主要功能性物质。

表3 处理前后刺梨汁功能性成分含量

Table 3 Functional component content ofR.roxbunghiijuice before and after treatment

项目Item酶解前Before enzymolysis酶解后After enzymolysis多酚/(mg/mL) Phenols126.44±8.43 a108.33±6.65 b总黄酮/(mg/mL) Total flavones8.44±0.76 a7.83±0.59 aVC/(mg/mL)2218.33±10.22 a2106.72±12.32 aSOD(U/mL)186.33±7.90 a174.91±5.19 a水溶性蛋白质(μg/mL)44.32±3.23 a39.19±4.19 b Water soluble protein

注：同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters in the same row indicate significance of difference atP<0.05 level.

2.5共固定化复合酶的稳定性

由图3可知，随着重复次数的增加，刺梨汁的透光率逐渐下降，可能是与壳聚糖固定化酶失活有关。连续使用10次后，刺梨汁的透光率仍达74.11%，说明该固定化酶具有一定的操作稳定性。

3结论与讨论

试验表明，共固定化复合酶澄清刺梨汁的最佳工艺为壳聚糖固定化果胶酶与纤维酶的质量比3∶1、酶添加量20 g/L、酶解时间70 min、酶解温度55℃，在此工艺条件下，刺梨汁透光率达86.45%。壳聚糖固定化复合酶澄清刺梨汁可显著降低导致刺梨果汁混浊的多酚和水溶性蛋白质含量，分别下降14.32%和11.57%，而对刺梨汁中VC、SOD和总黄酮的影响不显著。