广西某奶牛场乳房炎病原菌的流行调查

王 玲，郭小权，胡国良，刘 佩，黄 橙，李 麟，李谷月，程素芳，阮业召，李庆庆，陈盈盈，刘 平*

（1.江西农业大学 动物群发性疾病监测与防治研究所/江西省畜禽疫病诊断与防控重点实验室，江西 南昌330045；2.江西农业大学 科技园，江西 南昌330045）

【研究意义】奶牛乳房炎是一种由病原微生物、物理损伤等多种因素造成的一种奶牛乳房炎性疾病，该病导致的主要病理变化为乳房实质、间质发生炎症，乳汁中成分发生改变，严重影响乳汁的产量和乳制品质量，进而对奶牛养殖业造成重大经济损失，同时也危害人类食品健康安全。【前人研究进展】天津地区的奶牛乳房炎流行病学调查发现，隐形乳房炎的发病率为50.72%[1]。郝景锋等[2]对吉林长春多个奶牛场进行调查发现乳房炎的发病率高达57.21%，罗金印等[3]对兰州地区奶牛乳房炎发病情况进行调查分析，结果显示奶牛隐性乳房炎的头阳性率为58.43%。有数据统计，全球每年奶牛乳房炎的发病率平均高达50%，美国、英国等发达国家奶牛乳房炎的发病率平均在40%左右[4]。奶牛患乳房炎后会引起牛奶的产量和质量下降，直接引起重大经济损失。在我国，每年因奶牛乳房炎造成的经济损失在150～450亿元[5]，因此，奶牛乳房炎的预防和治疗应该引起人们的重视。【本研究切入点】引起奶牛乳房炎的病因有很多，其中主要原因为病原微生物感染。目前，引起奶牛乳房炎的主要致病菌有4种：葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌和酵母样真菌[7]。除病原微生物外，有研究称，温度、湿度等环境因素与奶牛乳房炎的发病率有很大的关系[8]。而广西位于我国的亚热带地区，该地区温度高湿度大。【拟解决的关键问题】本试验结合环境及卫生情况对广西某奶牛场奶牛乳房炎发病率进行调查以及对病原菌进行分离鉴定，为今后进行药物敏感性分析提供依据，也为该地区奶牛乳房炎的防治提供一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 试验地区及动物

本研究选取的奶牛场位于广西南宁（东经108.22°，北纬22.48°），该地1985年至2014年平均降雨量1 180.3 mm，平均气温20.47℃，平均相对湿度79.07%（数据来自广西壮族自治区气象科学数据共享服务中心）。该场约有1 000头荷斯坦奶牛，当奶牛患有临床或隐性乳腺炎时，一般采用抗生素治疗，包括青霉素、链霉素和庆大霉素等。

1.2 奶牛乳房炎发病率调查

本试验通过加州乳房炎测试法（california mastitis test，CMT）检测奶牛乳汁中体细胞数，对奶牛乳房炎进行诊断，以此调查奶牛乳房炎的发病率。

1.3 样品的收集

对广西某奶牛场37头奶牛，在无菌的条件下进行人工取奶，牛奶样品置于15 mL的灭菌离心管中，立即冷藏保存，后送至江西农业大学临床兽医学实验室4℃保存待用。

1.4 培养基及主要试剂

沙氏琼脂培养基，改良马丁培养基，LB培养基（Luria-Bertani培养基），LA培养基（LB培养基固体形式），伊红美蓝培养基，革兰氏染色剂。

1.5 试验方法

1.5.1 真菌的培养与纯化 取适量无菌采集的乳样用三角玻璃棒凃板接种到沙氏琼脂培养基上，置于37℃生化培养箱培养12 h左右，用勾菌环选取圆形典型菌落，划线接种于新的沙氏琼脂培养基上，培养12 h后革兰氏染色，初步鉴定为真菌后送至北京擎科生物科技有限公司进行18S rRNA测序鉴定。

1.5.2 细菌的培养与纯化 取适量无菌采集的乳样用玻璃棒凃板接种到LA培养基上，置于37℃生化培养箱培养12 h左右，用勾菌环选取圆形典型菌落，划线接种于新的LA培养基上，培养12 h后革兰氏染色，初步鉴定为细菌形态后，送至北京擎科生物科技有限公司进行16S rRNA测序鉴定。

2 试验结果

2.1 奶牛场环境

经调查该牛场奶牛乳房炎的发病率与胎次、年龄关系相关性较低，各胎次与年龄均有发生，牛场内泥泞潮湿、饲喂方式不规范、环境卫生较差（图1）。主要用药有头孢噻呋钠，林可霉素，庆大霉素，青霉素，链霉素等。

图1 奶牛场内环境Fig.1 Environment of dairy farm

2.2 奶牛场发病情况

本试验调查结果发现，2013—2018年，该奶牛场临床型奶牛乳房炎的发病率为8.3%（图2），隐性乳房炎在干奶前检测，患病乳区占总乳区数的40%。

图2 临床型乳房炎发病率Fig.2 Incidence rate of clinical mastitis

2.3 临床症状观察

患有奶牛乳房炎的奶牛，乳房单侧肿胀不对称，乳头发红，触摸温度较高（图3）。牛奶中含有乳凝块（见图4）。

2.4 病原菌培养结果

在沙氏琼脂培养基上培养，可见乳白色单个圆形菌落（图5）。经革兰氏染色，在油镜下可观察到不同大小的南瓜子样菌体（图6）。

图3 患病奶牛乳房肿胀Fig.3 Swollen breasts of sick cows

图4 牛奶中乳凝块Fig.4 Milk clot in milk

图5 真菌培养结果Fig.5 The results of fungal culture

图6 真菌革兰氏染色结果（1 000×）Fig.6 The results of fungal Gram staining（1 000×）

LA固体培养基培养可见乳白色圆形单个菌落，伊红美蓝培养基培养可见有的呈金属光泽的圆形菌落，有的为乳白色圆形菌落（图7）。革兰氏染色观察可见粉色短杆状或球状菌体（图8）。

图7 细菌培养结果Fig.7 The results of bacterial culture

图8 细菌革兰氏染色结果（1 000×）Fig.8 The results of bacterial Gram staining（1 000×）

2.5 真菌的分离与鉴定

采集的37份奶样中，共分离得到真菌52株，将分离得到的真菌进行18S rRNA测序。结果显示，假丝酵母菌有38株占73.1%，毕赤酵母菌占25%，其中热带念珠菌最多有20株占38.5%。

表1 真菌分离鉴定结果Tab.1 The results of isolation and identification of fungi

2.6 细菌的分离与鉴定

本试验从采集的37株乳样中，分离得到细菌22株，进行16S rRNA测序。结果显示，克雷伯菌占54.5%，肠杆菌31.8%，大肠杆菌占22.7%，链球菌9.1%，葡萄球菌4.5%。

表2 细菌分离鉴定结果Tab.2 The results of isolation and identification of bacteria

3 讨论与结论

本试验调查发现，该奶牛场自2013年以来，临床型乳房炎的发病率在7.8%～8.5%，而隐性乳房炎的乳区发病率高达40%，虽然一直使用头孢噻呋钠，林可霉素，庆大霉素，青霉素，链霉素等抗生素进行治疗，但效果不明显，可能是病原微生物的抗药性增强导致。有研究称，隐性乳房炎的发病受环境卫生、饲养管理以及挤奶的方式等的影响[9]。笔者推测，该场隐性乳房炎的高发病率可能与场内环境卫生条件、饲养管理方式有关。因此，正确的挤奶方式、良好的环境卫生对减少乳房炎的发生有着关键作用。

本研究对患病奶牛的乳样进行病原菌分离鉴定，主要检测出的病原菌有热带念珠菌、大肠杆菌和链球菌，其中大肠杆菌、热带念珠菌及乳房链球菌均为环境性病原微生物。而该牛场位于高温高湿的广西，场内环境卫生条件较差，这可能是环境性病原菌增殖的主要原因。因此，在奶牛乳房炎的防治过程中，提高饲养管理水平，注意环境卫生，及时清理牛舍粪便，定期消毒，规范饲喂等对预防乳房炎的发生至关重要。

在分离得到的病原菌中，假丝酵母菌的分离率高达73.1%，其中热带念珠菌最多。有研究报道，在全球范围内，热带念珠菌的分布具有明显的地域差异[10-11]，在赤道附近的南亚地区，受热带环境、温度、湿度的影响，热带念珠菌的感染率较高[12]。另外，抗生素的大量使用，也有可能促进真菌的生长[1-14]。而广西高温高湿的亚热带气候特点，以及奶牛场长期使用抗生素，都有可能促进假丝酵母菌的增殖，使热带念珠菌的感染率增加。

因此，在奶牛乳房炎的防治过程中，应注意防重于治。搞好环境卫生，及时清理粪便异物，定期进行消毒，增强饲养管理。治疗时，应分析其致病原因，定期检测药物敏感性，合理配伍用药，避免滥用抗生素。