菜豆种子遗传变异的InDel分子标记分析

潘 磊，宋丽娟，高 桐，郭 瑞，王红波，陈禅友

（江汉大学 生命科学学院/湖北省食用豆类植物自然科技资源中心/湖北省豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心，湖北武汉430056）

【研究意义】菜豆（Phas eolus vul garis L.）（2 N=2X=22）为豆科菜豆属的一年生草本植物，是主要的食用豆类蔬菜之一。目前学术界认为菜豆有两个独立起源中心，分别是“南墨西哥及中美中心”和“南美洲中心”[1]。菜豆又被称为四季豆、芸豆、玉豆等，在世界范围内广泛种植，而我国的菜豆栽培面积和产量居于世界前列[2]。据记载，菜豆在15世纪传入中国，栽培历史较长，类型丰富，分布广，种植面积大。截至2016年3月，经过中国农业科学院编目入库的菜豆（粒用类型为主）约有5 677份[3]。在农业生产中，依据生长习性，可将菜豆划分为直立型和蔓生型[4]；依据用途，又可分为粒用菜豆和荚用菜豆。随着市场需求的变化，培育高产优质抗性好的菜豆品种，一直是菜豆育种的主攻方向。对不同种质资源的遗传背景进行分析，区分种质间的差异，鉴定亲缘关系，遗传多样性评价等，对于育种具有重要意义。因此，利用分子标记技术进行辅助育种成为当前育种的研究焦点之一。【前人研究进展】插人/缺失（InDel，insertion/deletion）标记是指在近缘种或者同一个物种不同个体之间的基因组同一位点的序列发生的不同大小核苷酸片段的插入或缺失，是同源序列比对产生的空位现象[5-6]。InDel在基因组上数量多，分布广。InDel分子标记本质上仍然属于DNA序列长度多态性的标记。InDel标记作为一种共显性的分子标记，准确性高、稳定性好，而且以PCR扩增技术为基础，检测方便，经济有效。目前，InDel标记已经广泛应用于农作物的分子基础研究中，进行基因型鉴定、遗传多样性分析、基因定位以及功能标记开发等。杨双娟等[7]采用甘蓝InDel标记进行种子纯度鉴定分析。魏利斌等[8]利用InDel分子标记进行芝麻遗传多样性分析，可将国内和国外芝麻资源划分为两大类，且绝大多数芝麻材料的亲缘关系较远。利用番茄粉红色果实相关基因的InDel标记，能有效区分红色、粉红色和杂合基因型，可以用于番茄苗期分子标记辅助选择[9]。在水稻中，采用InDel标记能判别水稻的籼粳属性，鉴别不同品种类型[10-12]。基于19个多态性InDel标记，构建了42个绿豆主栽品种的DNA指纹图谱，能鉴定绿豆品种真伪[13]。【本研究切入点】然而，在菜豆的InDel分子标记研究与应用方面，目前知之甚少，在为数不多的研究报道中，Moghaddam等[14]基于二代测序技术在菜豆中开发了2 687InDel分子标记，并对24个国外菜豆品种进行检测，筛选获得了172个多态性InDel标记。【拟解决的关键问题】本研究尝试将InDel标记应用于我国菜豆种质资源，分析其遗传多样性和遗传关系，从而为菜豆遗传资源的保护和遗传改良等提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究中供试的25份菜豆种质材料，均由湖北省食用豆类植物自然科技资源中心和湖北省豆类（蔬菜）植物工程技术中心提供（表1）。

表1 供试25份菜豆种质资源信息列表Tab.1 Information of 25 common bean accessions used in this study

1.2 实验方法

1.2.1 菜豆基因组总DNA的提取纯化及检测 使用植物DNA提取试剂盒（北京天根生物科技有限公司），提取菜豆基因组总DNA，具体步骤方法参见试剂盒说明书。用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测进行DNA检测。采用mySPEC超微量分光光度计（mySPEC，奥地利）测定DNA质量和浓度。

1.2.2 引物的设计和PCR的扩增 菜豆InDel分子标记引物序列参考Moghaddam等[14]，引物序列见表2，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 PCR扩增体系 采用25µL反应体系，其中2.5µL 10×buffer（含Mg2+），2.5µL dNTP（2.5 mmol/L），0.3µL Taq酶（5 U/µL），正向和反向引物各1µL（10µmol/L），DNA模板（50 ng/µL）1µL，ddH2O补足25µL。

在Nexus gradient梯度PCR仪（Eppendorf，德国）上进行扩增，反应程序为：95℃，预变性3 min；35个循环（95℃，40 s，最适退火温度，40 s，72℃，40s）；72℃延伸10 min。4℃保存备用。用20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的产物，用自动凝胶成像系统进行拍照记录。对于没有出现电泳条带的DNA样本重复进行PCR扩增。若重复3次仍无扩增产物，则认为扩增引物无效。

1.3 数据分析

1.3.1 菜豆籽粒农艺性状评价方法 对25个不同的菜豆种质，每个材料每次取50粒，重复3次，观测记录籽粒相关的农艺性状指标。用游标卡尺测量籽粒长度、籽粒宽度、籽粒厚度，观察种皮颜色，用天平称量50粒质量，再换算成百粒质量。

表2 菜豆中12个多态性InDel分子标记Tab.2 Twelve polymorphic InDel molecular markers in common bean

1.3.2 InDel分子标记评价方法 将扩增产物的带型录入Excel，采用PopGen32[15]软件计算遗传参数分析，包括期望杂合度（He，expected heterozygosity）、观察杂合度（Ho，observed heterozygosity）、引物多态性信息含量（PI C，polymorphism information content）、有效等位基因数（Ne，effective number of alleles per loci）和遗传多样性指数（I，Shannon’s Information index）。构建25个菜豆种质的0，1矩阵，采用NTSYS-pc 2.11软件[16]进行UPGMA聚类分析。

2 结 果

2.1 菜豆种子表型变异

供试25份菜豆种子表型变异比较结果（表3），单粒长度变异区间均在0.19 cm（SJ0182）～0.34 cm（-）（SJ0156），单粒宽度变异区间在0.12 cm（SJ0225）～0.20 cm（SJ0193），单粒厚度变异区间在0.10 cm（SJ0181）～0.19 cm（SJ0193），百粒质量变异区间在19.06 g（SJ0187）～53.00 g（SJ0179）。种皮的颜色大致可划分为纯色和花色两个系列。纯色主要包括为黄色（7份）、黑色（5份）、白色（4份）和红色（1份）；而种皮花色的类型包括红色带黄斑（4份）、黄色带红斑（2份）、红色带白斑（1份）和黄色带白斑（1份）。

表3 25份菜豆籽粒统计分析Tab.3 Statistic analysis of seeds variation of 25 common bean accessions used in this study

图1 25份菜豆种子表型Fig.2 Seeds of 25 common bean accessions in this study.Cluster of 25 common bean accessions based on UPGMA.

2.2 菜豆InDel标记多态性分析

利用12对InDel多态性引物对25份菜豆种质资源进行了检测（图2），共探测到26个InDel位点（表4），平均位点数是2.17个。引物的平均有效等位位点数为1.78个，多态信息含量P IC平均值是0.33，期望杂合度（He）平均值为0.42，观察杂合度（Ho）平均值为0.52，群体的遗传多样性指数I为0.63。

图2 InDel引物NDSU_IND_09_00.4358的多态性电泳Fig.2 Polymorphism of the amplification products using InDel primer NDSU_IND_09_00.4358

表4 12个InDel标记在25份菜豆种质中的多态性信息Tab.4 Genetic variation of twelve polymorphic InDel markers in 25 common bean accessions

2.3 菜豆种质资源的聚类分析

为探寻供试菜豆资源之间的遗传关系，对25份菜豆种质资源进行UPGMA聚类分析（图3）。聚类结果表明，遗传相似性系数在0.5～0.95，相似系数为0.54时，供试的菜豆材料可分为5类。

第I类7份材料（SJ0156、SJ0185、SJ0160、SJ0227、SJ0201、SJ0203和SJ0243），第II类5份材料（SJ0180、SJ0209、SJ0181、SJ0182和SJ0215），第III类5份材料（SJ0179、SJ0225、SJ0192、SJ0193和SJ0222），第IV类4份材料（SJ0162、SJ0202、SJ0226和SJ0245），第V类4份材料（SJ0187、SJ0232、SJ0229和SJ0234）。

进一步分析发现，聚类结果与其种皮颜色存在一定相关性。第I类的7份材料中大多数纯色类型，其中黄色3份（SJ0227、SJ0201、SJ0243、SJ0185）、黑色2份（SJ0160、SJ0203）、红色1份（SJ0156）；第II类5份材料中以纯色类型为主，籽粒多为白色，其中白色3份（SJ0180、SJ0181、SJ0215），黑色1份（SJ0182），SJ0209的种皮虽然是花色，但也存在白色斑点区域；第III类5份材料的籽粒以花色类型为主，共有4份花色材料（SJ0179、SJ0225、SJ0192、SJ0193），种皮具有红斑、黄斑或者白斑；第IV类4份材料的籽粒以花色类型为主，大多与黄色相关，其中3份材料的种皮为全黄色（SJ0162）或部分黄色（SJ0202、SJ0226）；第V类的4份材料的籽粒都为纯色，多为黄色类型（SJ0232、SJ0229、SJ0234），另有一份黑色类型（SJ0187）。综上，纯色系列包括第I、II、V类（黄色、黑色、白色、红色），花色系列包括第III、IV类（黄色带红斑、红色带黄斑、红色带白斑）。这种色系的遗传差异可能是由于在进化过程中受到人工选择的影响而造成的。

此外，在遗传相似系数为0.95时，有两份菜豆材料虽然种皮颜色不同（SJ0180为白色和SJ0209为黄色带白斑），但是本研究中的InDel标记无法区分两者，可能是由于两者的亲缘关系较近，InDel标记数量不够而造成的。

图3 25份菜豆种质资源的UPGMA聚类分析Fig.3 Cluster of 25 common bean accessions based on UPGMA

3 讨论

InDel标记是一种共显性分子标记，在基因组上分布广泛，密度大，适宜于进行全基因组分子标记的发掘[17]。当前随着高通量测序技术的不断进步，InDel标记开发成本逐渐降低[18]。InDel标记的实质是一种DNA片段长度多态性遗传标记，能利用PCR扩增进行基因型分型，检测技术快捷经济，可在电泳平台上进行。因此，InDel标记是近年来一种较为热门的DNA分子标记技术，广泛应用于种质资源分析、分子辅助遗传育种、群体遗传分析、图位克隆、基因定位及遗传图谱的构建等研究[12][19]。在农作物研究领域，InDel分子标记技术已在水稻[20]、玉米[21]、油菜[22]、黄瓜[23]等作物研究中进行了报道。但是，在菜豆中的In-Del研究还十分有限，尤其是针对菜豆种子遗传变异的InDel标记研究尚未见报道。

然而，评价菜豆种子的遗传多样性，揭示个体间的遗传背景差异和亲缘关系，对于菜豆育种而言是十分重要而且必要的。因此，本研究引入InDel标记技术，用于分析我国菜豆种子的遗传变异特点。通过多个遗传多样性参数（观测杂合度、期望杂合度、有效等位数、引物多态信息含量等）分析，反映出供试菜豆种质资源具有中等水平的遗传多样性。其中，P IC值是评判基因片段多态性的重要参数之一。12对InDel引物的平均P IC＞0.3，多态性程度较高，能有效区分基因型之间的差异，其中两个InDel引物（NDSU_IND_09_00.4358和NDSU_IND_01_05.0609）的PI C＞0.5，将有利于应用在菜豆的遗传多样性分析和遗传图谱构建等研究中。为研究不同菜豆材料之间的遗传关系，基于12对InDel多态性引物对25分菜豆种质材料的结果，进行UPGMA聚类分析，可将其分为5类。聚类结果表明供试种质的地区间分类界限不明显，但是绝大多数材料的聚类与种皮颜色有关，可大致区分纯色和花色的种皮，推测这种种皮颜色的遗传差异，可能是受到人工选择的影响。此外，有两个菜豆材料无法区分开来，可能需要更多的多态性InDel分子标记。

综上，本研究将12对菜豆InDel多态性引物成功应用于25份菜豆材料的分子标记研究。研究结果不仅揭示了供试菜豆种质的中等遗传多样性水平，也反映出了不同种质之间的遗传关系，还能用于品种DNA指纹图谱的构建。因此，本研究将为菜豆遗传资源的评价、鉴定和保护利用等提供分子依据。