蔓性千斤拔HPLC-DAD 指纹图谱建立

严雪梅，彭 倩，许泽恭，周 园，赵钟祥，廖琼峰，陈丰连，张 蕾

（广州中医药大学中药学院，广东 广州510006）

千斤拔具有补肝肾、祛风湿、强腰膝等功效，民间常用于治疗风湿性关节炎、腰腿痛、肺虚久咳、白带、月经不调等症［1］，是妇科千金片、金鸡胶囊、壮腰健肾丸、活络止痛丸等中成药的主要原料药［2］。千斤拔为豆科植物蔓性千斤拔Moghania philippinensis（Merr.et Rolfe.） Li.、大叶千斤拔Moghania macrophylla（Willd.） O.Kuntze 或锈毛千斤拔Moghania ferruginea（Wall.ex Benth.） Li.的干燥根［3］。从历版《中国药典》 对千斤拔基原的收载情况可见，其应用历史最久，是目前种植和使用的主流品种，且分布最广，产量最高［4］，其质量标准还未被2015 年版《中国药典》收录。目前，蔓性千斤拔质量研究主要集中于种植技术［5-7］和黄酮类成分研究［8-10］，而指纹图谱研究较少［4，8］。蒙蒙等［4］建立的方法，虽然确立了22 个共有峰，但只指认了5个。孙辉等［8］只建立并未对指纹数据进行挖掘。现有文献研究对于控制蔓性千斤拔药材的质量不够全面。HPLC／QTOF-MS 技术则可以对中药的化学成分结构进行定性表征，以更有效地控制药品质量；综合运用HPLC 指纹图谱及HPLC／Q-TOF-MS 技术，可有效地评价中药质量，确保药品疗效［11］，因此，本课题组采用HPLC-DAD-QTOF-MS 联用技术研究蔓性千斤拔指纹图谱，以期为其质量标准的制定提供参考。

1 材料

Triple-TOFTM5600+三重四极杆飞行时间质谱（美国AB 公司）；LC-20 A 高效液相色谱仪，配有LC-20 AT 二元泵、SPD-M 20 A 二极管阵列检测器、CTO-20 A 柱温箱、SIL-20 A 自动进样器和LCsolution 色谱工作站管理软件（日本岛津公司）；AL 204 分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；SB 25-12 DTD 超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司生产）。

乙腈（色谱纯，德国默克公司）；甲酸（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；蒸馏水［华润怡宝饮料（中国） 有限公司］；其他试剂均为分析纯。药材购买于广州市各大药店或药材公司，产地为广东、广西、湖北、云南等地，由广州中医药大学周劲松副教授鉴定为豆科植物蔓性千斤拔Moghania philippinensis（Merr.et Rolfe.） Li.的干燥根。

2 方法与结果

2.1 检测条件

2.1.1 色谱条件 Waters Symmetry C18色谱柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流动相0.1% 甲酸水（A） -乙腈（B），梯度洗脱（0～35 min，10%～40% B；35～70 min，40%～70%B；70～105 min，70%～95%B；105～110 min，95%B；110～120 min，95%～10%B）；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；检测波长254 nm；进样量20 μL。

2.1.2 质谱条件 ESI 离子源，负离子模式检测。离子扫描范围m／z100～1 500；雾化气压379.23 kPa；辅助气压力379.23 kPa；气帘气压力341.33 kPa；雾化温度（TEM）550 ℃；源喷雾电压（ISVF） 4 500 V；解簇电压（DP）100 V；碰撞能（CE） 45 V；碰撞活化扫描（CES） 15 V；液相按1 ∶1 分流比进入质谱，采用Peakview 2.1 软件对质谱数据进行分析。

2.2 供试品溶液制备 蔓性千斤拔根药材干燥粉碎后过2号筛，称取样品粉末约1.00 g，精密称定，置于50 mL 具塞锥形瓶中，加入甲醇10 mL，超声（250 W，80 kHz） 提取30 min，滤过；滤渣加入85%乙醇10 mL，继续超声处理30 min，滤过，合并2 次滤液，加甲醇定容至25 mL，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1” 项条件下连续进样6 次，测得各共有峰相对保留时间RSD 小于1.0%，相对峰面积RSD 小于5.0%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 按“2.2” 项下方法平行制备供试品溶液6 份，在“2.1.1” 项条件下连续进样6 次，测得各共有峰相对保留时间RSD 小于2.0%，相对峰面积RSD 小于5.0%，表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1” 项条件下，分别于0、2、4、8、12、16、24 h进样，测得各共有峰相对保留时间RSD 小于2.0%，相对峰面积RSD 小于5.0%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4 HPLC-DAD 指纹图谱

2.4.1 指纹图谱建立 将36 批蔓性千斤拔药材，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1” 项条件下进样。将得到的色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012A 版），生成色谱叠加图见图1。以S2 为参照图谱，采用平均数法，时间窗宽度为0.5 min，经多点校正及色谱峰匹配，生成共有模式图，共标定30 个共有峰，建立了蔓性千斤拔对照指纹图谱，见图2。

图1 36 批样品HPLC 指纹图谱

图2 蔓性千斤拔对照指纹图谱

2.4.2 聚类分析 本研究以36 批样品的30 个共有峰的相对峰面积作为变量，得到36 × 30 阶原始数据矩阵，导入到SPSS 22.0 软件，采用组间联结法及欧氏距离作为样品测度对36 批药材进行聚类分析，结果见图3。聚类结果表明，36 个产地的蔓性千斤拔主要分为2 类，有28 个不同来源的蔓性千斤拔药材被聚为一类，表明市售的蔓性千斤拔药材质量相对稳定和相似，不具有明显的地域区分性。S3、S4、S7、S10、S17、S26、S31、S32 这8 批药材与其他批次分开，并分为一类。

图3 36 批样品聚类树状图

2.4.3 正交偏最小二乘法-判别分析 依据聚类分析结果，对已经聚为一类的2 组样品Gr.1 （S1、S2、S5、S6、S8、S9、S11～S16、S18～S25、S27～S30、S33～S36） 和Gr.2（S3、S4、S7、S10、S17、S26、S31、S32） 进行正交偏最小二乘法-判别分析。见图4，所有样品明显分为2 类，与聚类分析结果一致。

图4 36 批样品OPLS-DA 得分图

2.4.4 相似度评价 将生成的蔓性千斤拔对照指纹图谱与36 批样品的色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012A 版），计算出样品与对照图谱的相似度，并用夹角余弦、相关系数和欧氏距离计算相似度，结果见表1。与对照指纹图谱相比较，除了S3、S4、S10、S17、S26、S32外，其余各批蔓性千斤拔药材的相似度都在0.820 以上，表明其质量相对稳定。比较发现相似度与聚类分析和OPLS-DA 结果基本一致，所以相似度分析可用于蔓性千斤拔药材质量一致性评价。另外，结合聚类分析和OPLS-DA结果及相似度结果，发现欧氏距离计算相似度较夹角余弦和相关系数能更好的对蔓性千斤拔药材的差别进行识别。

2.4.5 共有峰鉴定 选取色谱信息丰富及与对照指纹图谱相似度高的一批蔓性千斤拔样品（S2），按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1” “2.1.2” 项条件下对蔓性千斤拔的30 个特征指纹峰进行指认。利用HPLC／Q-TOFMS 获得的准分子离子峰精确相对分子质量信息及MS／MS获得的二级碎片并结合保留时间信息等与文献报道［12-15］蔓性千斤拔化学成分进行比对，指认其中20 个共有峰的可能结构，见表2。

3 讨论

本实验采用甲醇、45% 乙醇、55% 乙醇、65% 乙醇、75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇作提取溶剂，以共有峰峰面积作为评价指标。结果表明，低浓度乙醇提取液在保留时间60～100 min 内色谱峰面积较小，峰形不佳，而甲醇及85%乙醇提取液均色谱峰数较丰富，主要色谱峰面积较大，且甲醇提取液中后半段共有峰的峰面积较为明显，85%乙醇提取液中，前半段共有峰的峰面积较为明显，故选定第1 次提取溶剂为甲醇，第2 次提取溶剂为85%乙醇的提取方法。同时，采用全波长扫描，提取254、260、275、320、360 nm 下色谱图，以色谱峰数目、丰度和分离度为测评指标，确定最佳测定波长为254 nm。另外，对乙腈-0.1% 甲酸和甲醇-0.1%甲酸流动相进行考察，发现乙腈-0.1%甲酸水作流动相进行梯度洗脱时各色谱峰分离度较好。

表1 36 批样品相似度

表2 36 批样品共有峰鉴定

续表2

通过优化色谱条件，最终建立了分离度好、色谱峰较全面的蔓性千斤拔HPLC 指纹图谱，共标定了30 个共有峰。通过HPLC／Q-TOF-MS 指认了其中20 个共有峰。

对36 批样品进行聚类分析，被聚为2 类，不具有明显的地域区分性；且相似度都在0.820 以上，提示其质量相对稳定，聚类分析和正交偏最小二乘法-判别分析与相似度分析结果基本一致。

千斤拔药材现行质量标准为湖南、上海、广东等地方药材标准，仅设置了性状、显微、薄层色谱鉴别等项目，均缺少指纹图谱等专属性较强的鉴别项目［7］。本研究采用HPLC-DAD-QTOF-MS 联用技术研究蔓性千斤拔指纹图谱特征性，以期为其质量标准的建立和后续的谱效相关研究提供参考。