北沙参多糖分离纯化及经肠道菌群降解对体外免疫细胞增殖的影响

于钦辉，杜宝香，杜以晴，杨 佳，马青云，文 冉，容 蓉

（山东中医药大学药学院，山东 济南250355）

北沙参为伞形科植物珊瑚菜Glehnia littoralisFr.Schmidtex Miq 的干燥根，是临床上常用中药。本品性甘、微苦、性微寒，归肺、胃经。有益胃生津、养阴清肺之功效，临床上主要用于肺热燥咳、劳嗽痰血、胃阴不足、热病津伤、咽干口渴等症［1］。研究表明北沙参所含的主要成分有香豆素、木脂素、聚炔类、多糖类等［2］。其中多糖类成分含有量最高有调节或增强机体免疫功能，治疗阴虚证的作用［3］。目前对北沙参多糖的研究更多的偏向于提取工艺优化及理化性质等方面［4-5］，对其免疫活性的研究较少。课题组报道过纯化后的北沙参多糖对脾淋巴细胞的增殖活性的影响［6］，但尚未见关于纯化后的北沙参多糖经肠道菌群降解后对免疫细胞增殖活性影响的相关报道。

大多数中药多糖在疾病治疗方面发挥着关键作用，但大分子碳水化合物在人体内很难被直接吸收。肠道微生物群在人类消化生理及大肠内稳态有着很重要的作用［7］。肠道中某些类型微生物可以多糖为能量来源，将其分解为易利用的小分子物质，从而使多糖更好地发挥提高机体免疫力的作用［8］。大量研究结果显示，北沙参化学成分众多，其中多糖被认为是北沙参重要的有效成分之一［3-6］。然而目前对北沙参单糖组成等初步结构表征研究较少，并且由于多糖本身不易被机体吸收，故其作用机制始终未能明确。本研究对获得的2 种多糖组分进行单糖组成分析，并通过小鼠肠道菌群在体外对多糖成分进行降解，测定2 种单糖降解前后对细胞增殖活性的影响，以期为肠道菌群在中药代谢中的作用提供依据。本研究旨对分离纯化得到的北沙参多糖，通过肠道菌群体外降解，观察其对小鼠巨噬细胞、脾脏细胞增殖活性的影响，探讨肠道菌群对体内多糖的降解作用及增效机制。

1 材料

1.1 仪器 UV-2550 型紫外分光光度计（日本岛津仪器有限公司）；安捷伦6890 N 型气相色谱仪、安捷伦1200 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；Mettler AE240 电子天平（十万分之一，瑞士梅特勒公司）；高速离心机TD5A（盐城凯特实验仪器有限公司）。

1.2 药材与试剂 北沙参药材购于山东省中医院（批号170501），经山东中医药大学徐凌川教授鉴定为伞形科植物珊瑚菜Glehnia littoralisFr.Schmidtex M iq 的干燥根。对照品D-无水葡萄糖（批号MUST-14072601，纯度＞98%）、D-（+） -木糖（批号MUST-16041913，纯度＞98%），均购自成都曼斯特生物科技有限公司；对照品L-岩藻糖，L-鼠李糖（批号SA0411GA13，纯度＞98%），D-阿拉伯糖（批号AJ0702FA14，纯度＞98%），D-甘露糖（批号AA0416LA13，纯度＞98%），D-半乳糖 （批 号YM0506YA14，纯 度＞98%），均购自上海源叶生物科技有限公司；DEAE-52 纤维素（批号20170622，北京索莱宝科技有限公司）；牛血清白蛋白（批号130102，上海伯奥生物科技有限公司）；考马斯亮蓝G-250 （批号20130102，国药集团化学试剂有限公司）；厌氧培养基（批号20180410，山东拓普生物工程有限公司）；浓硫酸（批号20160508，莱阳经济技术开发区精细化工厂）；苯酚、无水乙醇、正丁醇、三氯甲烷、氯化钠、氢氧化钠等均为国产分析纯试剂。

1.3 动物与细胞株 BALB／c 雄性小鼠，体质量18～20 g，购自北京维通利华实验动物有限公司RAW264.7 细胞，购自上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。本研究涉及的动物实验经山东中医药大学伦理委员会批准，批准号2016-007。

2 方法

2.1 北沙参粗多糖制备 称取北沙参药材2.0 kg，粉碎，过4 号筛，加入6 倍体积80% 乙醇，加热回流提取2 次，每次2 h，抽滤，提取液另器存放；药渣自然晾干至无醇味，加入10 倍量水于94.9 ℃浸提2 次［9］，每次120 min，2 次提取液合并，离心取上清液，上清液浓缩后加入4 倍量无水乙醇于4 ℃冰箱静置过夜，过滤取沉淀，沉淀冷冻干燥后得北沙参粗多糖，在干燥器中放置保存。

2.2 北沙参多糖分离纯化 采用DEAE-52 纤维素对北沙参粗多糖进行分离。取“2.1” 项下北沙参粗多糖适量，蒸馏水溶解，分别以蒸馏水、0.05、0.1、0.3 mol／L NaCl溶液梯度洗脱，等体积收集流分，苯酚-硫酸法跟踪检测，以洗脱管数为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制洗脱曲线，合并同一洗脱峰流分，冷冻干燥，分别制得蒸馏水、0.05、0.1、0.3 mol／L NaCl 溶液洗脱组分（D1、D2、D3、D4）。取得率较高的流分D1、D2 做后续分析［10］。

2.3 蛋白质含有量测定 以0.100 6 mg／mL 的牛血清蛋白溶液为对对照品溶液，分别量取对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于具塞刻度管中，加去离子水补足至1 mL，分别向每只试管中加入3 mL 考马斯亮蓝G-250 溶液，混匀后室温放置20 min，以蒸馏水为空白，在紫外585 nm 处测定其吸光度［11］。

样品液制备，精密称取“2.2” 项下D1、D2 组分适量，配成质量浓度约为10.0 mg／mL 的供试品溶液，后续操作同对照品的处理方法。

2.4 总糖含有量测定 以0.145 8 g／L 的葡萄糖溶液为对照品溶液，分别量取对照品溶液0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL 于试管中，加去离子水补足至总体积2 mL，每个浓度重复3 个样品，分别向每只试管中加入5%苯酚溶液1.0 mL，浓硫酸5.0 mL，迅速混合均匀。沸水浴中反应30 min，以蒸馏 水为空 白，在490 nm 波长下进行扫描［11-12］。

样品液制备，精密称取“2.2” 项下D1、D2 组分适量，配置成0.145 8 g／L 的多糖溶液，取0.7 mL，加去离子水补足至2 mL，后续操作同对照品的处理方法。

2.5 北沙参多糖单糖组成分析

2.5.1 北沙参多糖组分完全酸水解 精密称取D1、D2 组分10.00 mg 于10 mL 具塞试管中，加入2 mol／L 三氟乙酸（TFA） 适量溶解多糖组分，置于100 ℃烘箱中水解10 h，40 ℃氮气吹干，甲醇洗涤，吹干，重复此操作3～4 次，至TFA 蒸发完全。

2.5.2 标准单糖衍生物制备 分别称取L-鼠李糖、D-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-无水葡萄糖、岩藻糖、D-半乳糖、D-木糖各5 mg，分别加入盐酸羟胺5 mg，吡啶0.55 mL，肌醇六乙酸酯4 mg，混合均匀，于90 ℃水浴中反应30 min。取出，待温度降至室温，加入0.55 mL 乙酸酐，90 ℃水浴反应30 min 使乙酰化反应完全。75 ℃氮气吹干，氯仿溶解，过0.22 μm 滤膜于液相小瓶中，备用。取各对照单糖衍生物100 μL，混合均匀，得混合对照单糖衍生物，供GC分析用［13］。

2.5.3 水解多糖衍生物制备 取“2.5.1” 项下水解多糖样品适量，按“2.5.2” 项下方法进行衍生化处理，氯仿溶解，过0.22 μm 微孔滤膜于液相小瓶中，备用。

2.5.4 色谱条件 HP-5 毛细管柱 （320 μm× 30 m，0.25 μm）；FID 检测器；升温程序为初始温度170 ℃保持3 min，以2 ℃／min 速率升至230 ℃，保持5 min；载气N2；进样器温度250 ℃；检测器温度300 ℃；氮气体积流量1.2 mL／min，氢气体积流量30 mL／min，空气体积流量300 mL／min；进样量1.0 μL；进样方式分流进样；分流比60 ∶1。

2.6 多糖在肠道菌群中的体外降解［14-15］

2.6.1 厌氧培养液制备 称取厌氧培养基9.5 g 于1 L 蒸馏水，加热煮沸2 min 使彻底溶解，分装，120 ℃高压灭菌15 min，备用。

2.6.2 小鼠肠道菌群培养液制备 取小鼠新鲜粪便适量粉碎后置于100 mL EP 管中，按1 g ∶ 30 mL 的比例加入厌氧培养液，充分涡旋，离心（1 000 r／min） 10 min，取上清。将上清液转移至培养皿内，每皿30 mL，37 ℃气浴震荡培养24 h，即得。

2.6.3 小鼠肠道菌群对北沙参多糖的降解 分别向“2.6.2” 项下培 养皿中加入 D1、D2 多糖水溶液（5 mg／mL）5 mL，混匀，继续37 ℃气浴震荡12 h。同时设置空白对照组，即以等体积的蒸馏水代替多糖溶液。分别收集不同皿内的培养液，离心（8 000 r／min） 10 min 取上清液，上清液用500 Da 的超滤膜进行超滤，以去除培养液成分对后期实验的干扰。取膜内溶液，冷冻干燥后得到北沙参多糖降解产物。

2.6.4 降解产物分析 Agilent PL aquagel-OH MIXED-M 凝胶柱（7.5 mm × 300 mm，8 μm）；流动相去离子水；进样量10 μL；体积流量1.0 mL／min；柱温35 ℃；RID 检测器温度40 ℃。已知分子量对照品多糖为Dextran T 系列对照品品，分子量分别为5、10、12、50、100 kDa，以其分子量对数值与其相应保留时间作标准曲线。将降解前后的色谱图进行对比并对多糖降解结果进行分析。取降解前后的北沙参多糖样品适量，蒸馏水溶解，过0.45 μm 微孔滤膜，备用。

2.7 多糖及其降解产物对脾淋巴细胞及巨噬细胞增殖活性研究［16-17］

2.7.1 小鼠脾淋巴细胞制备 取清洁级BALB／c 雄性小鼠，脱颈椎处死，70%酒精浸泡5 min，于超净工作台内用手术剪剖开小鼠腹部，取出脾脏，用注射器吸取PBS 缓冲液冲洗脾脏中血液，以除去红细胞。冲洗干净后脾脏经200 目筛网研磨，收集研磨液置于1.5 mL 离心管中，离心（1 000 r／min，10 min），弃 上清，用RPMI-1640 培养液（加10%血清和1%双抗） 重悬细胞制得。

2.7.3 MTT 法测定细胞增殖 取RAW264.7 细胞稀释至1×105／mL，接种于96 孔培养板中，每 孔100 μL，37 ℃，5% CO2培养12 h 后，加入不同浓度的多糖溶液（15.6、31.2、62.5、125、250、500 μg／mL） 100 μL，继续孵育24 h。对于脾淋巴细胞，按 “2.7.1” 项下方法制得后，稀释细胞浓度至1 × 106／mL，接种于96 孔培养板中，直接加入上述不同浓度的多糖溶液100 μL，培养44 h。各实验组同时设置空白对照组，即不加药液加入等体积的培养基。各细胞加药培养相同时间后，每孔加入10 μL MTT，培 养4 h 后，弃上清，每孔加 入100 μL DMSO 溶 液，37 ℃震 荡10 min 后，于酶标 仪490 nm 处测定各孔OD 值，实验重复3 次后取平均值进行分析。

3 结果

3.1 北沙参多糖分离纯化 北沙参多糖经DEAE-52 纤维素柱层析分离得到4 个北沙参多糖组分D1、D2、D3、D4。其中D3、D4 组分得率较低，故仅对D1、D2 组分进行后续实验分析。

3.2 蛋白质含有量测定 以牛血清白蛋白对照品溶液的浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（Y），得线性回归方程Y＝7.475 1X+0.864 （R2＝1）。根据方程计算北沙参多糖D1、D2 组分中蛋白含有量分别为0.03%、0.14%。

3.3 总糖含有量测定 以葡萄糖对照品溶液的浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标 （Y），得线性回归方程Y＝15.592 0X-0.038 4 （R2＝0.999 1），根据方程计算北沙参多糖D1、D2 组分中总糖含有量分别为72.99%、80.04%。

3.4 单糖组成分析 混合对照品单糖及D1、D2 组分GC色谱图谱图见图1，记录各色谱峰的保留时间。测得各单糖的摩尔比，结果见表1。

3.5 多糖的肠道菌群降解产物分析 分离纯化后的多糖D1、D2 分别被小鼠肠道菌群降解，得到降解产物DD1、DD2。本实验采用凝胶渗透色谱对肠道菌群降解前后的北沙参多糖进行分析。见图2，可知DD1、DD2 的保留时间较之于D1、D2 明显增加，表明北沙参多糖在肠道菌群作用下降解为分子量较小的多糖。

3.6 北沙参多糖及其肠道菌群降解产物对脏细胞及巨噬细胞增殖作用的影响

3.6.1 对脾淋巴细胞增殖作用 由图3 可知，与空白对照组比较，D1、DD1 均能促进小鼠脾淋巴细胞的增殖，且在实验浓度下，呈现钟罩型量-效关系，在质量浓度62.5 μg／mL时增殖活性达到最大。图中显示，在质量浓度15.6、250 μg／mL 时D1 的增殖活性强于DD1，其他质量浓度下，DD1 的增殖活性明显强于D1 组分。

图1 各成分GC 色谱图

表1 各多糖单糖组成

图2 各多糖降解前后HPLC 色谱图

图3 D1 及其降解产物对小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响

由图4 可知，与空白对照组相比，D2、DD2 均能促进小鼠脾淋巴细胞的增殖，D2 的增殖活性在质量浓度125 μg／mL 时达到最大，DD2 的增殖 活性在 质量浓 度250 μg／mL 时达到最大。图中显示，在质量浓度250 μg／mL 时DD1 的增殖活性强于D1，其他质量浓度下，2 组分的增殖活性差别不明显。

图4 D2 及其降解产物DD2 对脾淋巴细胞增殖活性的影响

3.6.2 对巨噬细胞增殖作用比较 由图5 可知，与空白对照组比较，D1、DD1 均能提高小鼠巨噬细胞的增殖。在质量浓度31.2、125 μg／mL 时D1 和DD1 的增殖活性分别达到最大。图中显示，在质量浓度小于62.5 μg／mL 时D1 的增殖活性强于DD1，在质量浓度大于62.5 μg／mL 时DD1的增殖活性强于D1。

图5 D1 及其降解产物DD1 对小鼠巨噬细胞增殖活性的影响

由图6 可知，与空白对照组比较，D2、DD2 均能提高小鼠巨噬细胞的增殖，且在实验浓度下，呈现钟罩型量-效关系。在质量浓度62.5 μg／mL 时增殖活性达到最大。图中显示，DD2 的增殖活性明显强于DD1。

4 讨论

图6 D2 及其降解产物DD2 对小鼠巨噬细胞增殖活性的影响

目前，常用的单糖测定色谱方法主要包括HPLC 法、离子色谱法、气相色谱法和高效毛细管色谱法［18］，其中HPLC 法灵敏度较低［19］，离子色谱法虽然灵敏度较高，但糖类在电极表面能将某些分子氧化或还原，并且易受环境温度的影响，进而对结果产生影响［20］。气相色谱法具有测定结果准确、灵敏度高、适应性强等特点，因此本实验中多糖采用三氟乙酸进行水解并进行GC 分析，区别于课题组之前的HPLC 分析。

北沙参成分复杂，研究表明北沙参有诸多的药理活性［21］。多糖在北沙参中含有量较多，具有增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的作用［22］。课题组之前在北沙参多糖提取工艺优化［9］、结构表征［23］及纯化后多糖的体外活性免疫研究［6］等方面做过详细报道。据报道，目前市场上含多糖的中成药制剂品种中口服制剂约占总品种的74.00%［24］。但是多糖在人体内很难被直接吸收，其在人体内的吸收代谢过程及作用机制尚不明确。胃肠道是口服药物的必经通道，其中大肠内丰富的肠道菌群，在药物的降解过程中起着重要的作用［25］。肠道菌群通过还原、脱羟、脱糖、脱甲基、乙酰化、脱羧等代谢反应，转化多种异物，可能形成新的活性物质，进而提高药效。本研究首次将分离纯化的北沙参多糖与肠道菌群降解相结合，探讨多糖在经肠道菌群降解后对细胞增殖活性的影响。

本研究尚存在若干不足之处，北沙参多糖降解产物的单糖组成与分子量范围，以及体内肠道菌群降解过程与降解产物的药效作用机制，有待于进一步研究。