北沙参花粉形态特征、活性及萌发条件研究

(河北中医学院，石家庄 050200)

北沙参为安国八大祁药之一，为伞形科植物珊瑚菜(GlehnialittoralisFr. Schmidt ex Miq.)的根。北沙参味甘甜，是临床常用的滋阴药，养阴清肺，祛痰止咳，主治肺燥干咳、热病伤津、口渴等症[1]，为河北省的道地药材，每年全国需求量在5 000 t左右，是一个大宗药材品种。

注：A为ck(BK培养基)；B为TTC染色；C为I2-KI 染色；D为亚甲基蓝染色。图1 花粉的活性检测

近年来，野生北沙参的资源已经无法满足市场需要，市场上主要是人工栽培品种。对北沙参的研究主要集中在栽培条件[2]和药理药效研究[3-4]，对于北沙参的优良品种选育研究的较少。伞形科植物柴胡[5-6]、防风[7]、明党参[8]、当归[9]和阿魏[10]的花粉研究已经有报导，并通过对花粉的研究进一步对上述药材进行良种选育，但北沙参的花粉研究还未见报道。因此，本文通过研究北沙参的花粉活性及贮存条件，观察北沙参花粉的形态特征，为北沙参的良种选育奠定基础。

1 实验材料

样品采自河北中医学院药用植物园，经河北中医学院药学院郑玉光教授鉴定为珊瑚菜(GlehnialittoralisFr. Schmidt ex Miq.)，选择盛花期的枝条作为实验材料。

2 实验方法

2.1 花粉活性检测

采用TTC法、I2-KI 染色法、亚甲基蓝染色法和离体萌发法检测花粉活性。TTC法和I2-KI 染色法参照《植物生理学实验指导》第四版[11]的方法进行，亚甲基蓝染色法参照宫丽婷等[12]方法进行。染色后，在10倍显微镜下观察，每张装片统计100个，重复3次。

离体萌发采用琼脂培养，其中蔗糖分数、硼酸及氯化钙的浓度均参照刘保才等[13]的方法进行，筛选出最适于北沙参花粉萌发的培养基配比。将花粉均匀抖落在凹面载玻片的培养基上，25 ℃恒温培养12 h，利用10倍显微镜进行观察，每张载玻片统计100个，重复3次。

2.2 贮藏温度和时间的筛选

在北沙参的盛花期采摘其花序，轻轻的将花序放入牛皮纸袋内，分别置于常温(室温)、低温(4 ℃)和冷冻(-20 ℃)条件下贮藏。每天10：00时取样，将花粉抖落在琼脂培养基上(培养基成分为2.1中筛选出的最适于北沙参离体萌发的成分配比)，于25 ℃恒温黑暗培养12 h，然后进行花粉萌发的观察和统计，连续观察统计10 d。

2.3 贮藏湿度和时间的筛选

根据2.2的实验方法筛选出最适于北沙参贮藏的温度，将盛花期新鲜的北沙参花序的花粉抖落于相对湿度为15%、32%、52%、66%、81%、95%的密闭盒子的固体培养基上(培养基成分为2.1中筛选出的最适宜北沙参离体萌发的成分配比)，黑暗培养12 h后观察统计花粉的萌发率，连续观察15 d。

表1 不同盐类在25 ℃密封中的相对湿度[14]

盐相对湿度/%LiCl·H2O15CaCl2·2H2O32NaHSO4·H2O52NaNO266(NH4)2SO481Na2HPO4·12H2O95

2.4 花粉形态特征观察

将盛花期的北沙参花序的花粉轻轻弹落在载物铜台的导电双面胶上，放入JEOL JFC-1600中喷射镀金，然后置于JSM-6390 LV扫描电镜下观察。选择不同的视野观察北沙参花粉的群体、个体和花粉表面纹饰。测量20个具有代表性的花粉粒的极轴长和赤道轴长，计算极赤比，同时测量其萌发沟的沟宽和沟长，观察萌发沟的形态。

2.5 数据统计与处理

利用Excel 2010软件处理实验数据，利用Photoshop 7.0软件处理图片。

注：A为BK培养基；B为第11组培养基。图2 花粉的离体培养

表2 离体培养各培养基的组分和花粉萌发率

处理 各处理的组分 萌发率/% 蔗糖/%硼酸/(mg·mL-1)氯化钙/(mg·mL-1)重复1重复2重复3平均值F值Pr>F多重比较1组00.000.0051.645.453.050.096.436<0.0001CD2组00.100.1027.028.021.125.4F3组50.100.1037.848.650.245.5CD4组100.000.1054.459.046.753.4C5组100.050.1041.444.745.643.9DE6组100.100.1054.441.339.645.1DE7组100.200.1052.757.562.557.6BC8组100.100.0042.143.735.940.57DE9组100.100.0541.138.249.342.9DE10组100.100.2038.739.632.937.1E11组200.100.1073.364.780.872.9A12组50.050.1039.030.032.133.7EF13组50.100.0569.854.065.062.9B14组100.050.0523.420.625.023FBK组10.10.03610.74.06.9G

注：不同字母表示差异显著p<0.01。

3 实验结果

3.1 花粉的活性检测

分别用TTC法、I2-KI 染色法和亚甲基蓝染色法对花粉粒进行染色观察，结果表明，TTC不能将北沙参的花粉染成红色(图1 A)，用I2-KI对北沙参花粉粒进行染色，全部花粉粒都呈现黄色(图1 B)，利用亚甲基蓝对北沙参花粉粒进行染色，结果发现96%的花粉都被染成了蓝色或浅蓝色(图1 C)，说明亚甲基蓝染色法可以检测北沙参花粉活性，而TTC法和I2-KI 染色法不适合检测北沙参花粉粒活性。

3.2 花粉的离体培养

根据刘保财等[13]的花粉离体萌发

的最适条件的筛选方法，筛选出最适合北沙参花粉萌发的蔗糖、硼酸和氯化钙的配比：20%蔗糖+0.1% mg·mL-1硼酸+0.1% mg·mL-1氯化钙，萌发率可达72.9%(图2 B，表2)。

3.3 贮藏时间和温度对花粉活性的影响

在冷冻、低温或室温条件下，北沙参花粉的萌发率随着贮藏时间的延长而下降。在室温下保存的北沙参花粉的萌发率一直高于冷冻和低温贮藏的花粉，冷冻贮藏的花粉萌发率最低且下降最快。这可能是因为北沙参的盛花期为北方的5月份，当时的气候条件较适于花粉的存储，同时由于采集并保存的是北沙参的花序，因此北沙参的花粉在常温下一直保持较好的活性。而低温和冷冻使北沙参花粉经历了一个冷害的过程，从而使其萌发率降低。

图3 不同贮藏方法和时间对北沙参花粉粒活性的影响

注：A为花粉粒极面观；B为花粉粒赤面观；C为花粉粒表面网孔；D为花粉粒萌发沟；E为花粉粒群体；F为将要萌发的花粉粒。图5 北沙参花粉粒的形态特征观察

3.4 贮藏时间和湿度对花粉活性的影响

由3.3的结果可知，随着花粉贮藏时间的延长其生活力逐渐下降，只有在室温大约25 ℃的情况下，北沙参的花粉才能够在贮藏1 d后保持60%左右的萌发率。因此，选择室温下贮藏的北沙参花粉，将其置于不同湿度的环境中进行萌发，结果发现贮藏1 d的花粉由于不同的湿度呈现出不同的萌发率，在湿度15%～52%的情况下花粉的萌发率能够达到70%以上，但是湿度达到60%以上后，花粉的萌发率只有50%左右。随着贮藏时间的延长，各湿度情况下花粉的萌发率都在逐渐降低，而湿度超过60%以后，花粉的萌发率明显降低。这说明北沙参的最适花粉萌发湿度在15%～52%之间，大于这一湿度的环境会导致花粉萌发的减少。

图4 不同贮藏湿度对北沙参花粉粒活性的影响

3.5 北沙参花粉形态特征观察

通过电镜扫描观察，北沙参的花粉赤道面观为超长方形，极面观为三角形。极轴长为38.5～44.5μm，赤轴长为12.1～15.0μm，极赤比为3.20；具有3个萌发沟，沟长为24.5～31.3μm，沟宽为3.09～7.04μm；花粉粒表面是纵横交错的网状纹饰，其间具有一些大小不均的小孔(图5 C)。在盛花期，花粉粒大部分发育良好(图5 E)。收集盛花期后的花粉粒观察会发现部分花粉粒有要萌发的迹象，或者说为萌发做好了准备(图5 F)。

4 讨 论

常用的花粉测定方法有TTC法、I2-KI 染色法、离体培养法等，亚甲基蓝法并不常用于花粉活性测定。利用TTC法和I2-KI 染色法都不能很好的反映北沙参花粉的活性，这与防风花粉活力测定的结果相同[13]，而亚甲基蓝染色可以使北沙参花粉呈现蓝色、浅蓝色等，可以很好的区分花粉是否有活性。但是，利用亚甲基蓝染色会导致结果偏高，这在多种植物的花粉活性测定中都呈现这一现象[15-16]。

北沙参花粉的萌发未见明显伸长的花粉管。观察在25 ℃培养24 h，48 h甚至72 h的花粉粒，萌发的北沙参花粉粒只是在花粉的中部出现一个凸起，并未形成长的花粉管，这与伞形科防风的花粉管形态相似，而且防风的花粉粒形态也同北沙参相似为超长椭圆形。

大多数植物的花粉在低温或超低温保存的情况下其活性都较室温或冷冻的花粉活性高[13,17]，但是贮藏在室温的北沙参花粉的萌发率高于低温及冷冻的花粉，这可能是因为北沙参的花粉盛花期在北方的5月份，此时的天气干燥温暖，湿度较低，很适合北沙参花粉的保存。而低温以及冷冻的环境条件下，湿度相对较大，使北沙参的花粉经历了一个冻害的过程，从而导致其生活力下降。 由于低温环境下北沙参的花粉活性就开始下降，因此未利用超低温来保存北沙参的花粉，北沙参的花粉是否适于超低温保存需要进一步研究。

伞形科花粉形态共有6种，即近菱形、近圆形、椭圆形、近长方形、超长方形和赤道收缩形[18]。北沙参花粉形态为超长方形，极面观为三角形，具有3个萌发沟，表面具有错综复杂的纹饰，与伞形科防风的花粉粒相似，但比防风的花粉粒更长，与伞形科棱子芹属太白棱子芹的花粉外形相似[19]。在所有已知的伞形科各属的花粉特征差别较大，即使同一属花粉的外形、极面观和表面纹饰也不尽相同，这可能与花粉的活性及萌发特性相关。因此北沙参不同类群之间花粉的差别以及其在良种选育中的作用将有待于进一步研究。