基于网络药理学探究银黄药对抗病毒作用机制

沈 汶蒋卓霖吴雨晴梁 杰郝宣润雷奇林

（1.成都医学院，四川 成都610050； 2.四川科瑞德制药股份有限公司，中枢神经系统药物四川省重点实验室，四川 泸州646100）

金银花属于寒性植物，为忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb 干躁花蕾或带初开的花，为常用中药。具有清热解毒、凉散风热之功效，主治痈肿、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热等症，应用历史悠久［1］。黄芩始载于《神农本草经》，为唇形科多年生草本植物黄芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根。其味苦、性寒，具有清热燥湿、止血安胎、泻火解毒、抗炎、抗癌、抗菌、抗病毒等功效［2］。用银黄配伍制成的银黄制剂具有清热解毒、消炎之功效，通常用于治疗上呼吸道感染、扁桃体炎、烧伤烫伤感染等［3］。现在银黄药对配伍研究主要集中于银黄药对的主成分研究、质量控制及药理作用研究［4-6］等方面。而病毒在宿主细胞内要成功的复制需要宿主细胞的细胞因子参与，对于其复杂作用机制的研究有助于理解宿主细胞中细胞因子在病毒复制过程中的作用，并指导相关抗病毒新药开发［7］。但目前尚未见对 银黄药对抗病毒的作用机制报道。因此，本文运用网络药理学方法探究银黄药对抗病毒作用机制及其物质基础。

1 材料与方法

1.1 银黄药对成分筛选 通过文献调研与挖掘的方法，选取金银花［8-10］与黄芩［11-13］中主要质量控制与药效成分共16种，见表1。通过中药系统药理学分析平台［14］（TCMSP，http： ／ ／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php） 与PubChem （https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov ／）［15］查找并导出16 种化学分子的三维化学结构数据，保存为∗.mol2 文件格式。

1.2 银黄药对主要活性成分潜在靶点预测 黄芩主要含有黄酮类成分（黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等），金银花主要含有绿原酸及其异构体等有机酸（绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸） 和苷类物类（金丝桃苷、木犀草素、忍冬苷、檞皮素）。将导出的化合物分子结构以mol2 （∗.mol2） 文件格式提交到PharmMapper 网络服务器（http： ／ ／59.78.96.61／pharmmapper／） 进行反向对接以预测其作用靶点。PharmMaper 是根据反向药效团匹配法，实现预测潜在靶点与生物活性成分的对接的服务器。其会对BindingDB、Targetbank、PDTD、Drugbank 4 大数据库进行检索以获取药物潜在靶点的信息，这使得预测靶点信息更加可靠精确［16］。将选择靶点集（select target set）设置为“仅人类蛋白质靶点” ［human protein targets only（v2010，2241）］，其余参数不变。下载每个成分的反向对接预测结果，将对接得分Z 值（Z scores） 以降序排列，依据其对接得分选取每个成分的前20 个靶点作为靶点与该化合物相关的重要靶点。由于PharmMapper 对接结果中的药物靶点存在命名不规范以及为方便进行下一步研究，因此本文采用Uniprot 数据库的搜索功能（http： ／ ／www.uniprot.org ／）［17］，将得到的靶点代码统一转换为人源基因代码［Organism： Homo sapiens （Human）］。如将Cell division protein kinase 6、Angiogenin、Proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src 分别转换为CDK6、ANG、SRC。在经过转换之后，获取活性成分相关的靶点信息。

1.3 药物-化合物-预测靶点网络构建与关键靶点的筛选 将银黄药对中药物、活性成分、预测靶点导入Cytoscope3.4.0 软件（http： ／ ／www.cytoscape.org ／） 中构建药物-化合物-预测靶点 （Drug-compound-predicted target network，DCTN） 网络。Cytoscape 是一个开放源码的生物信息分析软件，其核心架构是网络，每个节点（node） 表示的是基因、蛋白质或分子，节点与节点之间的边（edge） 则代表这些它们之间的相互作用，一个节点的度值（degree） 表示网络中节点与节点相连的数目，度值越大，则这个靶点越有可能是化合物的关键作用靶点。使用Cytoscope3.4.0 软件中的网络分析工具（NetworkAnalyzer）计算药物-化合物-预测靶点网络中的网络拓扑参数，这些参数包括了度值、介数 （betweeness centralit，BC） 等。BC 表示节点在特定网络拓扑中所有的最短路径中经过该节点的数目，反应了节点在特定网络中的枢纽程度。参考度值及BC 可以确定网络中的主要节点，进而确定关键靶点［18］。因此本文通过分析网络，确定银黄药对作用的关键靶点。

1.4 关键靶点-关键靶点相互作用分析 为了阐明预测靶点蛋白在系统水平上的作用，将银黄药对16 种主要活性成分相关的靶点上传至String 10.0 数据库（https： ／ ／stringdb.org／），获取相关蛋白相互作用信息。String 是一个贮存蛋白质相互作用的数据库，包括已知和预测的蛋白质，每一个蛋白质都会有一个相互作用的打分值，打分值高的则置信度高［19］。选取打分值大于0.9 作为蛋白之间相互作用的高置信度依据，得到关键靶点-关键靶点相互作用网络（Key protein-protein interaction network，KPPN）。

1.5 关键蛋白质表达位点的确定 蛋白质的表达位置能反应该蛋白质的功能，本文使用人类蛋白质图谱数据库（http： ／ ／www.proteinatlas.org）［20］分析蛋 白质的 表达位置。由于与抗病毒作用的靶点主要表达于免疫系统，因此本文统计关键蛋白在骨髓与免疫系统中的表达情况。

1.6 KEGG 通路富集分析 利用DAVID v6.8 数据库［21］对KPPN 网络中的关键靶点进行KEGG 生物通路富集分析。将关键基因列表粘贴至DAVID v6.8 数据库中，以人类全基因组为背景基因和参照集合，获得通路富集结果。

1.7 构建药物-成分-预测靶点-KEGG 信号通路网络 利用Cytoscope3.4.0 软件构建关键靶点-KEGG 信号通路（Key target-KEGG signaling pathway network，KTKN），并使用Cytoscope3.4.0 软件Merge 功能将DCTN 与KPPI 以及KTKN 网络融合，得到药物-化合物-关键靶点-KEGG 信号通路网络 （Drug-compound-key target-KEGG signaling pathway network，DCTK）。

2 结果

2.1 银黄药对成分筛选 通过文献挖掘，以主要质量控制标志物、药效成分为指标，共筛选出16 种成分。其中金银花中有10 种成分，包括绿原酸及其异构体等有机酸和苷类物质。黄芩中共6 种成分，主要为黄芩苷等黄酮类成分。见表1。

表1 银黄药对16 种活性成分

2.2 化合物-预测靶点网络构建与关键靶点的筛选 银黄药对的药物-成分-预测靶点网络见图1。该网络图中含有175 个节点（2 个药物、16 种成分、157 个靶点） 组成599条相互作用关系在银黄药对的药物-成分-预测靶点网络图中，靶点的平均度值为3.45，平均拓扑系数为0.013 6。以度值大于平均度值，拓扑系数大于平均拓扑系数的靶点作为关键靶点，其信息见表2。这些靶点中，度值最高的是血管生成蛋白质（angiogeninA，ANG），能与其它8 个节点相互作用；其次是度值为5 的靶点共计8 个，包括1 型非受体酪氨酸蛋白磷酸酶（Tyrosine-protein phosphatase nonreceptor type 1，PTPN1）、胰 腺 α-淀粉酶 （Pancreatic α-amylase，AMY2A）、丝氨酸／苏氨酸-蛋白激 酶Chk1（Serine／threonine-protein kinase Chk1，CHEK1）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src （Proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src，SRC）、细胞分裂蛋白激酶7 （Cell division protein kinase 7，CDK7）、细胞分 裂蛋白激酶2 （Cell division protein kinase 2，CDK2）、ADP-核糖基环化酶2 （ADPribosyl cyclase 2，BST1）、二氢叶酸还原酶（Dihydrofolate reductase，DHFR）。在药物-化合物-预测靶点网络中，每种药物含有多种成分，每一种成分能作用于多个靶点，每个靶点又能与其它多个靶点发生相互作用，这体现了中药多成分-多靶点的共同作用机制与整体性的治疗思路。

图1 银黄药对的药物-成分-预测靶点网络图

表2 银黄药对的药物-成分-预测靶点网络中的关键靶点及其拓扑学性质

2.3 关键靶点蛋白质-蛋白质相互作用分析 将筛选出的关键靶点输入String 10.0 数据库中，得到关键蛋白相互作用网络（KPPI）。这些靶点之间的相互作用关系如图2所示。在KPPI 网络中，DHFR、CDK7、CHEK1、CCNA2、CDK2、SRC、PTPN1 几个蛋白质之间存在较为密切的相互作用，这提示银黄药对在发挥抗病毒作用时可能通过这些靶点网络发挥作用，同时也提示着各成分之间可能存在的协同作用。

2.4 关键蛋白质表达位点的确定 排除掉与其他靶点没相互作用的靶点，将剩余的关键靶点输入人类蛋白质图谱数据库中，统计出各个靶点在人体骨髓与免疫系统中的表达情况，如表3 所示。从表3 可以看出，相关靶点在骨髓与免疫系统中表达程度较高，从侧面印证了银黄药对具有较好的抗病毒效果。

2.5 KEGG 信号通路富集分析 7 个靶点主要涉及到5 条信号通路（表4）。这5 条通路中，2 条通路与抗病毒作用有关，包括病毒致癌通路（Viral carcinogenesis） 和乙型肝炎通路（Hepatitis B）；2 条与细胞增殖有关，包括细胞周期信号通路（Cell cycle）、细胞粘连信号通路（Adherens junction）；一条与转导有关，即信号通路p53 信号通路（p53 signaling pathway）。以P＜0.05 为功能显著性与通路富集临界值，筛选出与抗病毒相关的信号通路，病毒致癌通路（Viral carcinogenesis）、乙肝病毒通路（Hepatitis B）。

图2 关键靶点之间的相互作用网络图

表3 关键靶点在人体各组织表达

2.6 药物-成分-靶点-KEGG 信号通路网络的建立 使用Cytoscope3.4.0 软件构建关键靶点-KEGG 信号通路网络（Key target -KEGG signaling pathway network，KKN），并用Cytoscope3.4.0 软件Merge 功能将DCTN 与KPPI 以及KKN网络融合，得到药物-成分-靶点-KEGG 信号通路网络（DCTK），见图4，显示了药物、成分、靶点、KEGG 信号通路之间的关系。从图中可以看出，在筛选出来的两条信号通路中，银黄药对中共有5 种成分（金银花3 种，黄芩2种） 可以作用于这些通路中的关键蛋白，这提示这些成分可能是银黄药对中发挥抗病毒作用的主要成分。

表4 银黄药对关键靶点KEGG 信号通路富集分析

图4 药物-成分-关键靶点-KEGG 信号通路网络

3 讨论

文献报道银黄药对常用制剂如银黄颗粒［5］、复方银黄口服液［22］、银黄注射液［23］等具有体内、体外抗病毒作用。主要成分包括绿原酸、木犀草素、隐绿原酸、黄芩苷、黄芩素等，这与本研究结果一致。除此之外，本研究发现，黄芩中的2s-5，7，2′，6′-四羟基黄酮可能也具有抗病毒作用，目前已经有文献报道了该化合物具有抗菌作用［24］。

CDK2、CDK7、SRC、DHFR、CHEK1、CCNA2 等几个靶点是银黄药对抗病毒的主要作用靶点。银黄药对中的有效成分既可通过直接作用于某一靶点而发挥抗病毒作用；也可通过作用于多个靶点，通过各靶点的相互作用而间接发挥抗病毒作用。CDK2 与CDK7 是细胞周期素依赖性激酶家族成员，与细胞周期的调控有关，作用于中心体与DNA的复制过程。CDK2 能够使CTNNB1、CDK7、p53／TP53 等蛋白质磷酸化，在G1-S 发挥作用。通过使得cyclin B／CDK1磷酸化来调控cyclin B／CDK1 在中心体与细胞核中的激活，进而控制进入有丝分裂与减数分裂的时期。CDK 家族与多种重要的人类疾病病毒的复制密切相关［25］。在CDK2 功能缺陷型的宿主细胞中，病毒的复制具有感染剂量依赖性，当CDK2 活性被诱导激活时，病毒进入快速的裂解性复制。因此推测银黄药对中的有效成分（如绿原酸、木犀草素、隐绿原酸） 能够抑制CDK2、CDK7 的表达而抑制病毒在人体内的复制过程，进而达到抗病毒的作用。SRC 是一种非受体蛋白酪氨酸激酶。SRC 在病毒感染与肿瘤疾病方面起着重要作用，例如乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）可通过介导SRC 激酶活化以及SRC 激酶家族信号转导，为HBV 在哺乳动物肝脏内病毒复制提供关键功能［26］。因此推测银黄药对中的有效成分能抑制SRC 激酶的活化并阻断相关信号通路达到抑制病毒复制的作用。CCNA2 编码一种细胞周期蛋白A2，能够控制细胞周期中的G1／S 和G2／M 过渡阶段。其作用机制是通过与CDK1 与CDK2 形成丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶全酶复合物，赋予这些复合物的底物特异性［27］。因此推测银黄药对中的有效成分可能通过CCNA2进而调节CDK2 而达到抗病毒的目的。DHFR 编码二氢叶酸还原酶（Dihydrofolate reductase），二氢叶酸还原酸是叶酸代谢的关键酶，能够催化DNA 前体合成的必要反应。因此推测银黄药对中的有效成分通过抑制二氢叶酸还原酶的表达，进而抑制DNA 前体的合成而达到抑制病毒复制的作用。CHEK1 能够编码丝氨酸／苏氨酸蛋白质酶1 （Serine／threonine-protein kinase Chk1），其在由检查点介导的细胞周期停滞与DNA 修复中是必须的。有研究证明，用CHK 抑制剂处理产生的细胞可以保护它们免受病毒介导的毒性并减少后代病毒的滴度［28］。因此推测银黄药对中的有效成分通过抑制CHEK1 的表达，能够减少病毒对细胞DNA 的损害并修复受损的DNA，同时减少细胞受到的病毒毒性作用。

本文运用网络药理学方法报道银黄药对的抗病毒作用。发现银黄药对抗病毒的作用机制可能是直接或间接抑制与病毒复制相关的关键蛋白质的表达，抑制DNA 前体合成而抑制病毒的复制，减少宿主细胞DNA 受损并修复受损的DNA，减少宿主细胞受到的病毒毒性作用。但需要指出的是，本文研究结果仍需要通过进一步的实验加以证明。