秦皮甲素对溃疡性结肠炎小鼠肠黏膜的改善作用

陈韵之，田 蕾

（1.锦州医科大学附属第一医院消化内科，辽宁 锦州121000； 2.锦州医科大学附属第一医院消化内科，辽宁 锦州121000）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC） 是常见的慢性非特异性结肠炎症，病因复杂，发病机制尚未完全明了［1］。现已有文献指出，氧化损伤、遗传、环境、免疫、感染以及精神状态等因素在UC 的发生发展中均发挥着一定的影响作用［2］。随着近年来UC 发病机制研究的不断深入，多种因素共同作用这一解释逐渐得到诠释，其中，氧化损伤反应在UC 发生发展中的作用也逐渐受到临床研究人员的重视。有研究指出，环氧化酶-2 （cyclooxyenase-2，COX-2） 是一类与结肠癌发生密切相关的炎症因子，不仅与肿瘤的发生密切相关，在机体的炎症反应中，也扮演着重要角色［3］。诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS） 是一种重要的炎性介质，在机体炎症的发生过程中发挥着举足轻重的作用，其在被激活后，可明显加重机体肠黏膜的炎性损伤程度和范围，且其在机体组织内水平与机体黏膜组织的炎症程度以及炎症范围呈明显的正相关关系［4］。本研究拟通过比较秦皮甲素对UC 小鼠结肠组织中COX-2 和iNOS 表达影响，探究秦皮甲素对UC 的作用。

1 材料

1.1 动物 BALB／c 雄性小鼠90 只，体质量21～24 g，购于辽宁长生生物技术股份有限公司（生产许可证号SCXK（辽）2015-0001）。饲养室温度23～25 ℃，相对湿度55%～65%，12 h 明暗交替，基础饲料喂养，自由饮食饮水。

1.2 药物与试剂 秦皮甲素（纯度≥980 mg／g，陕西柏科生物科技有限公司）；葡聚糖硫酸钠（DSS，大连美仑生物科技有限公司）；柳氮磺胺吡啶（SASP，武汉远成共创科技有限公司）；全蛋白提取试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE 凝胶快速制备试剂盒、羊抗兔IgG-HRP（沈阳万类生物科技有限公司）；PVDF 膜（美国Millipore公司）；苏木精、DAB 显色液、山羊血清（北京索莱宝科技有限公司）；COX-2 抗体、iNOS 抗体、Nrf2 抗体（沈阳万类生物科技有限公司）。

1.3 仪器 石蜡切片机（德国Leica 公司）；显微镜拍照系统sc-180 （日本Olumpus 公司）；HRP 标记山羊抗兔IgG（美国Thermo Fisher 公司）。

2 方法

2.1 造模及分组 90 只BALB／c 雄性小鼠适应性饲养1周。造模前均禁食24 h，采用随机数字表法随机分为正常组、模型组、柳氮磺胺吡啶组及秦皮甲素低、中、高剂量组，每组15 只。参照文献［6］ 造模，除正常组自由饮水外，各组大鼠经饮水途径给予2.5 %DSS，连续7 d，结束DSS 干预后用正常饮水替代DSS 饲养2 周；柳氮磺胺吡啶组小鼠给予柳氮磺胺吡啶（200 mg／kg） 灌胃，秦皮甲素低、中、高剂量组小鼠分别给予75、150、300 mg／kg 秦皮甲素灌胃，正常组和模型组采用生理盐水（20 mL／kg） 灌胃，给药3 周。

2.2 取材 给药3 周后，取小鼠的结肠组织，对其肠组织进行蛋白质的提取。剪取结肠病变最明显处置于4%甲醛溶液中进行固定，酒精脱水，石蜡包埋，切片，苏木素-伊红（HE） 染色和免疫组化（ICH）。

2.3 疾病活动指数（DAI） 评分 根据小鼠日常状态评分，包括大便性状、大便隐血、体质量下降等3 个方面的内容，具体评分标准为大便性状及颜色均正常，大便隐血实验阴性，体质量未见减轻为0 分；大便性状及颜色正常，大便隐血阴性，体质量下降约1%～5% 为1 分；大便松散不成形，大便隐血呈阳性反应，体质量减轻约5%～10%为2 分；大便松散不成形，大便隐血实验呈阳性，体质量减轻约10%～15%为3 分；大便细软不成形，可见肉眼血便，体质量减轻＞15% 为4 分［7］。DAI 值为3 个方面内容总分的均值，DAI＝ （体质量指数+大便形状+出血情况） ／3。

2.4 COX-2、iNOS、Nrf2 表达 采用Western blot 法检测小鼠结肠组织中COX-2、iNOS、Nrf2 蛋白表达，所有的操作方法均按照文献及试剂盒说明书操作检测。

2.5 HE 染色及组织学损伤指数（TDI） 评分 根据小鼠病变组织HE 染色评分，包括炎症、病变深度、隐窝破坏、病变范围4 个方面的内容，具体评分标准为黏膜完整，未见明显炎症反应，病变范围约1%～25 %为0 分；可见黏膜轻度炎症，但仅局限于黏膜下层，约有1／3 基底隐窝破坏，病变范围26%～50% 为1 分；黏膜可见重度炎症，病变深及肌层，约有2／3 基底隐窝破坏，病变范围51%～75%为2分；病变深及浆膜层，表面上皮仅完整可见，病变范围76%～100%为3 分；炎症反应较重，未见完整黏膜，全部隐窝和上皮均被破坏为4 分［8］。TDI 值为4 个方面内容总分的均值，DAI ＝ （炎症+病变深度+隐窝破坏+病变范围）／4。

2.6 免疫组化 所有组织切片均在普通光镜下盲法读片，以细胞胞质、部分胞核、胞膜出现棕黄色或棕色颗粒为COX-2、iNOS 表达阳性，以无棕黄色出现为COX-2、iNOS表达阴性。

2.7 统计学分析 采用SPSS 19.0 软件进行统计分析，计量资料以（） 表示；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验。以P≤0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组小鼠DAI 评分 与正常组比较，模型组小鼠DAI评分偏高（P＜0.05），且柳氮磺胺吡啶组小鼠DAI 评分也升高（P＜0.05）。与模型组比较，秦皮甲素低、中、高剂量组小鼠DAI 评分降低（P＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠DAI 评分比较（， n＝15）

表1 各组小鼠DAI 评分比较（， n＝15）

注：与正常组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

3.2 各组小鼠肠组织COX-2、iNOS 蛋白表达 与正常组比较，模型组COX-2、iNOS 蛋白表达上调，而秦皮甲素干预后，COX-2、iNOS 蛋白表达下调，见图1～2。后续实验，选用秦皮甲素中剂量组与柳氮磺胺吡啶组进行实验。

图1 Western blot 检测各组小鼠肠组织COX-2 表达

图2 Western blot 检测各组小鼠肠组织iNOS 表达

3.3 各组小鼠肠黏膜损伤 HE 染色结果显示，正常组小鼠肠黏膜形态正常，未见明显异常；模型组小鼠肠黏膜出现不同程度坏死或脱落表现，伴有不同程度充血、水肿及溃疡表现，黏膜层及黏膜下层可见大量淋巴细胞、中性粒细胞等炎症细胞浸润，部分切片有纤维组织增生表现；柳氮磺胺吡啶组、秦皮甲素中剂量组小鼠肠黏膜可见轻度水肿及溃疡表现，且柳氮磺胺吡啶组小鼠与秦皮甲素中剂量组小鼠肠黏膜水肿及溃疡表现相近见图3。

图3 各组小鼠肠黏膜HE 染色

3.4 各组小鼠TDI 评分 与正常组比较，模型组小鼠TDI评分增高（P＜0.05），与模型组比较，柳氮磺胺吡啶组和秦皮甲素中剂量组小鼠的TDI 评分降低（P＜0.05）。见表2。

表2 各组小鼠TDI 评分比较（， n＝15）

表2 各组小鼠TDI 评分比较（， n＝15）

注：与正常组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

3.5 各组小鼠肠组织COX-2 和iNOS 表达 COX-2 在正常组UC 小鼠肠组织中几乎不表达；COX-2 在模型组UC 小鼠肠组织中呈阳性表达，血管内皮细胞、结缔组织细胞、淋巴细胞、巨噬细胞及上皮细胞中均可见COX-2 表达增加，细胞胞核及胞质呈阳性表达；COX-2 在柳氮磺胺吡啶组及秦皮甲素中剂量组UC 小鼠肠组织中则呈弱阳性表达，上皮细胞、血管内皮细胞及结缔组织细胞等细胞胞核及胞质呈弱阳性表达见图4。

iNOS 在正常组UC 小鼠肠组织中不表达；iNOS 在模型组UC 小鼠肠组织中表达增强，在淋巴细胞、巨噬细胞等炎性细胞，以及上皮细胞、血管内皮细胞及结缔组织细胞等细胞中，胞核及胞质呈阳性表达；iNOS 在柳氮磺胺吡啶组及秦皮甲素中剂量组UC 小鼠肠组织中则成弱阳性表达见图5。

3.6 各组小鼠肠组织Nrf2 蛋白表达 与正常组比较，模型组小鼠UC 大肠组织中Nrf2 蛋白高表达（P＜0.05），与模型组比较，柳氮磺胺吡啶组及秦皮甲素中剂量组小鼠组织中Nrf2 蛋白水平进一步增高（P＜0.05），见表3、图6。

表3 各组小鼠组织Nrf2 蛋白表达比较（， n＝15）

表3 各组小鼠组织Nrf2 蛋白表达比较（， n＝15）

注：与正常组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

4 讨论

UC 是一种以慢性反复发作为特征的非特异性结肠炎症，受累部位主要为乙状结肠以及直肠，常累积黏膜及黏膜下层，其发病机制至今仍未明确［9-10］。目前认为，UC 的发生发展与多种因素的作用均有一定关联，例如感染、氧化损伤反应、环境、遗传以及免疫等多种因素。其中，由氧化损伤介导的免疫失衡及炎症反应，是UC 发生发展的重要促进因素［11-12］。

COX-2 是机体缺氧调控因子的重要靶基因产物，在机体细胞凋亡的调控中发挥着重要作用，同时还参与机体血管再生的靶向调节，在机体炎症反应以及肿瘤发生的过程中，均扮演着重要角色［13-14］。iNOS 则是一种主要表达于炎症细胞中的蛋白非依赖性酶，是诱导NO 生产关键酶的重要因子［15-16］。研究表明，Nrf2／COX-2 信号通路是机体重要的抗炎信号通路之一，同时也是机体重要的抗氧化应激系统之一，相关抗氧化基因表达的激活，能有效启动Nrf2 的抗氧化反应和排异反应，从而通过促进Nrf2 的高表达，形成对黏膜组织的保护作用［17-18］。本研究结果显示，柳氮磺胺吡啶和秦皮甲素均可有效改善DSS 诱导的UC 小鼠的肠组织炎症状态，改善小鼠肠黏膜的水肿状态，同时明显缓解小鼠肠黏膜的充血状态，提高小鼠肠黏膜的DAI 评分以及TDI 评分水平。在进一步的作用机制探究中，中剂量秦皮甲素能通过下调UC 小鼠肠黏膜中COX-2、iNOS 的表达，上调反向Nrf2 的表达水平，从而有效减轻小鼠的肠黏膜炎症状态，发挥抗炎抗氧化的作用。

图4 免疫组化检测各组小鼠肠黏膜COX-2 表达

图5 免疫组化检测各组小鼠肠黏膜iNOS 表达

图6 Western blot 检测各组小鼠组织Nrf2 蛋白表达

综上所述，秦皮甲素对DSS 诱导的UC 小鼠具有良好的治疗作用，可通过下调小鼠肠黏膜组织中COX-2、iNOS的表达，改善Nrf2 水平，发挥拮抗UC 小鼠肠黏膜炎症的作用。