不同规格延胡索中8 种生物碱比较

李 凯，原军宁，彭晶晶，芦夏阳，杨 靖，曹晓燕

（1.陕西师范大学，西北濒危药材资源开发国家工程实验室／药用资源与天然药物化学教育部重点实验室，陕西 西安710062； 2.陕西白云制药有限公司，陕西 汉中723200）

大部分中药材都有传统的等级划分标准［1］。中药材商品等级是影响中药材市场价格的重要因素。目前市场上中药材商品规格等级划分主要有6类，一是依据野生和栽培区分规格等级；二是依据个头大小（粗细） 区分规格等级；三是依据性状（质地、颜色、形态） 区分规格等级；四是依据产地区分规格等级；五是依据产地加工方法区分规格等级；六是依据纯度区分规格等级［2］。在当前的市场中，药材的大小和粗细在商品等级标准上占有重要地位。

延胡索（Corydalis Rhizoma） 又名元胡、玄胡等，是我国传统中药材，为罂粟科紫堇属多年生草本植物延胡索Corydalis yanhusuoW.T.Wang 的干燥块茎［3］。与白术、白芍、浙贝母、杭白菊、玄参、笕麦冬、温郁金并称“浙八味”。《本草纲目》中记载其“能行血中气滞，气中血滞，专治一身上下诸痛”［4］。东亚地区延胡索被广泛用于治疗胸胁、脘腹疼痛、经闭通经、产后瘀阻、跌扑肿痛等［5-8］。现代药理及化学成分研究表明，延胡索中主要有效成分是生物碱类［9］，原阿片碱具有镇痛、解痉、改善微血管、扩血管等作用［10］；盐酸巴马汀具有抑制癌细胞增长的作用［11］；盐酸小檗碱具有抗炎抗菌［12］、抗肿瘤作用［13］；去氢延胡索甲素（又称脱氢紫堇碱） 有明显的抗心肌缺氧缺血、抗炎、抗肿瘤、抑制血小板聚集等作用［14-18］；海罂粟碱对慢性疼痛有很好的疗效，并且没有耐药性［19］；四氢小檗碱具有抗高血压、抗心律失常、抗纤维性颤动、抗急性心肌梗死及对缺血再灌注损伤的治疗及保护作用［20］；延胡索乙素和延胡索甲素有镇痛和镇静催眠、抗心律失常、降血压以及钙拮抗等作用［21-22］，对慢性钝痛有极佳镇痛效果。

延胡索主要分布于浙江、安徽、湖北、河南等地［23］，自2000 年以后，随着沿海地区的高速发展，浙江种植延胡索的面积大幅度减少，主要种植地区逐渐转移到陕西汉中地区［24］。《76 种药材商品规格标准》 中延胡索分为一级（每50 g 45 粒内） 和二级（每50 g 45 粒以上）。目前在市场上流通的延胡索商品等级划分已由原来的粒度大小演变成直径大小，可划分为特等（直径＞1.2 cm）、一等（直径1.0～1.2 cm）、二等 （直径0.8～1 cm）、三等（直径＜0.8 cm）、统货［25］。市场上关于延胡索的规格划分主要依靠外观尺寸，虽然易于量化，便于商品的流通，但是缺乏活性成分含有量等内在品质的信息。本研究所建立的快速、准确的同时检测延胡索药材中8 种生物碱成分含有量的方法，以期为后续延胡索药材及饮片的质量控制和分析评价奠定基础。

1 材料

LC-20 A 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；KQ5200 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Milli 2Q 超纯水仪 （德国Millipore 公司）。Agilent 5 TC-C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm） 色谱柱（美国Agilent 公司）。对照品原阿片碱（批号06M18）、盐酸巴马汀（批号06Z18）、盐酸小檗碱（批号05Z18）、去氢延胡索甲素（批号06Z18）、海罂粟碱 （批号06Y18）、延胡索乙素 （批号12M17）、四氢小檗碱（批号06M18）、延胡索甲素（批号06Z18），纯度≥98%，均购自天津西玛科技有限公司。乙腈、甲醇为色谱纯，购自美国Fisher公司；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

延胡索新鲜块茎于2018 年5 月采集于陕西省汉中市城固县董家营村，洗净泥土后，置于50 ℃烘箱中烘干，粉碎过80 目筛。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent 5 TC-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A） -0.1%磷酸溶液（三乙胺 调pH 6.0，B），梯度洗 脱 （0～15 min，20%A；15～35 min，20%A～80%A）；体积流量1.0 mL／min；柱 温30 ℃；检测波 长280 nm；进样量10 μL。按以上色谱条件进行分析，各成分的分离度良好，色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 分别精密称取原阿片碱5.24 mg、盐酸巴马汀5.18 mg、盐酸小檗碱5.16 mg、去氢延胡索甲素5.06 mg、海罂粟碱1.13 mg、延胡索乙素4.60 mg、四氢小檗碱5.11 mg、延胡索甲素5.14 mg，一起混合 加入10 mL 量瓶定容，摇匀，得混合对照品溶液，再依次逐级稀释。

2.2.2 供试品溶液 取延胡索药材，按直径（d）划分了5 个等级，分别为一级d＞1.5 cm；二级1.2＜d＜1.5 cm；三级1.0＜d＜1.2 cm；四级0.8＜d＜1.0 cm；五级d＜0.8 cm，见图2，粉碎机粉碎，过80 目筛，精密称取0.5 g，加入圆底烧瓶中，精密加入浓氨试液-甲醇（1 ∶20） 混合溶液50 mL，称定质量，冷浸1 h 后加热回流1 h，放冷，再称定质量，用浓氨试液-甲醇（1 ∶20） 混合溶液补足减失的质量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25 mL，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL 量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

图2 不同规格延胡索Fig.2 Different grades of Corydalis Rhizoma

2.3 精密度试验 取同一份对照品，在“2.1” 项条件下，连续重复进样6 次，测得原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、去氢延胡索甲素、海罂粟碱、延胡索乙素、四氢小檗碱、延胡索甲素峰面积RSD分别 为2.17%、0.86%、1.34%、1.72%、2.4%、1.94%、1.52%、0.65%，表明仪器精密度良好。

2.4 稳定性试验 将供试品溶液于室温下放置，在“2.1” 项条件下，分别于0、2、4、8、16、24 h 进样6 次，测得原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、去氢延胡索甲素、海罂粟碱、延胡索乙素、四氢小檗碱、延胡索甲素峰面积RSD 分别为1.26%、1.84%、2.35%、1.78%、2.17%、1.55%、1.16%、1.96%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5 重复性试验 取同一延胡索样品6 份，约0.5 g，精密称定，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项条件下进样，测得原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、去氢延胡索甲素、海罂粟碱、延胡索乙素、四氢小檗碱、延胡索甲素峰面 积 RSD 分别为 1.14%、2.54%、2.18%、1.76%、2.42%、1.24%、2.69%、1.16%，表 明该方法重复性良好。

2.6 加样回收率试验 取已知含有量的延胡索样品6 份，每份约0.5 g，精密称定，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，分别滴加对照品母液1 mL，在“2.1” 项条件下进样，计算回收率。得原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、去氢延胡索甲素、海罂粟碱、延胡索乙素、四氢小檗碱、延胡索甲素的回收率（n＝6） 分别为99.7%、99.2%、98.3%、100.6%、102.5%、101.3%、98.4%、99.5%，RSD 分别为 2.21%、1.78%、1.56%、1.23%、0.94%、1.62%、1.02%、0.81%。

2.7 线性关系考察 精密称定原阿片碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、去氢延胡索甲素、海罂粟碱、延胡索乙素、四氢小檗碱、延胡索甲素各5.24、5.18、5.16、5.06、1.13、4.60、5.11、5.14 mg，溶解在10 mL 量瓶中，定容至10 mL，按等级稀释，得到7 个质量浓度梯度的对照品，在“2.1”项条件下进样，以对照品峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X） 进行回归，结果见表1。

表1 各生物碱线性关系Tab.1 Linear relationships of various alkaloids

2.8 样品含有量测定 取适量样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项条件下进样，记录峰面积，用外标法计算不同规格延胡索中8 种生物碱的含有量，结果见表2。

2015 年版《中国药典》 中规定，按干燥品计算，延胡索中含延胡索乙素不得少于0.050%。按照此要求，5 个等级延胡索中的延胡索乙素含有量均达到要求，其中五级（d＜0.8 cm） 延胡索中延胡索乙素含有量最高（0.13%）。

表2 各生物碱含有量测定结果（mg／g）Tab.2 Results of content determination of various alkaloids （mg／g）

利用SPSS 25.0 软件进行不同等级之间生物碱含有量的差异有统计学意义（P＜0.05），结果表明，不同等级的延胡索中盐酸巴马汀含有量不存在显著性差异；不同等级的延胡索中盐酸小檗碱、脱氢紫堇碱、海罂粟碱、延胡索乙素、四氢小檗碱和延胡索甲素含有量存在一定的差异，且这6 种生物碱含有量随着延胡索直径的增加而呈现下降的趋势。不同等级的延胡索中原阿片碱的含有量存在显著性差异，随着延胡索直径的增大呈现递增的趋势。

2.9 相关性分析 以SPSS 25.0 软件中的双变量相关性（皮尔逊相关系数，双尾检验） 分析8 种生物碱含有量之间的相关性，达到极显著差异时（P＜0.01），认为二者存在极显著相关；当P＜0.05时，认为二者存在显著相关；否则，不相关。结果见表3，表明原阿片碱和海罂粟碱、延胡索甲素含有量之间存在显著的负相关性；延胡索乙素和四氢小檗碱、延胡索甲素、盐酸小檗碱、去氢延胡索甲素含有量之间存在显著的正相关性。

表3 不同生物碱之间相关性分析Tab.3 Correlation analysis between different alkaloids

3 讨论

目前关于延胡索中多个生物碱成分含有量的同时检测已有相关报道，王欢等［26］利用高效液相色谱法同时检测了延胡索中9 种生物碱的含有量；陈东东等［27］比较了延胡索炮制前后7 种生物碱含有量的变化。本实验建立了同时检测延胡索中8 种生物碱成分的高效液相色谱法，相较于已有文献报道［26-27］，该方法耗时短，8 种生物碱成分在35 min之内能够得到有效分离和检测，节省了检测时间和试剂消耗。

对于延胡索中生物碱的含有量与商品等级之间的这种矛盾关系，目前有2 种解释。第一种解释是一些药材的次生代谢产物主要分布在药材的表皮部位，所以直径越大的药材表皮所占的比例越小，如黄芩［28］、丹参［29］等，随着生长年限的增长其根部直径越粗，表皮所占比例越少，药材中指标性成分含有量也就越少。第二种解释是植物在环境胁迫下会产生一系列变化来适应环境，恶劣环境能刺激植物次生代谢的积累和释放，但造成植物生长缓慢［30］，即植物初生代谢产物和次生代谢产物之间的动态平衡，也可以解释延胡索块茎小而生物碱含有量高这一现象。

吕秋菊等［31］发现延胡索商品等级越高、块茎越大，醇溶性浸出物越少，原阿片碱、延胡索乙素和延胡索甲素含有量有随等级升高而减少的趋势。本实验中原阿片碱的含有量随着延胡索直径的增大呈现递增，与之前的研究结果不一致［31］。在所测的8 种生物碱中，盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、去氢延胡索甲素、海罂粟碱、延胡索乙素、四氢小檗碱和延胡索甲素均属原小檗碱型生物碱，原阿片碱属于原托品碱型生物碱，海罂粟碱属于阿朴菲型生物碱，含有量具有正相关的5 种成分均属于原小檗碱型生物碱；虽然不同类型的生物碱具有共同的生源前体——酪氨酸，但其生源合成途径又属于不同的分支，在代谢流不变的情况下，一个分支的代谢流增加了，另一个分支的代谢流则会减少，可以解释原阿片碱和海罂粟碱、延胡索甲素含有量之间的负相关性。

延胡索乙素是2015 年版《中国药典》 中规定的标志性成分，但是临床上延胡索发挥药效是多种成分的协同作用，单一成分并不能评价延胡索的质量。基于现有评价方法和存在问题，刘昌孝等［32］于2016 年提出了中药质量标志物（Q-marker） 的概念。随后，张铁军等［33］基于化学成分生源途径及成分特异性、成分的量、药效、网络药理分析、药性及吸收入血及组织分布、成分的可测性等为标准，提出延胡索定性鉴别必须检验其中标志物的3种。本实验所检测的8 种生物碱包含了张铁军等所建议的7 种生物碱中的5 种，同时增加了阿朴菲型生物碱海罂粟碱，以及盐酸小檗碱和四氢小檗碱2种原小檗碱型生物碱，其中海罂粟碱被认为是延胡索主要药效物质基础之一，可作为质量标志物［33］。本实验结果显示，延胡索乙素和四氢小檗碱、延胡索甲素、盐酸小檗碱、去氢延胡索甲素含有量之间存在显著正相关，可以考虑选取延胡索乙素作为这5 种生物碱的代表，同时增加原阿片碱、盐酸巴马汀和海罂粟碱作为延胡索的质量标志物。

本研究发现，原阿片碱的含有量随着延胡索直径的增大呈现递增，因此，如果以单一的原阿片碱含有量作为内在品质评判的标准，那么延胡索商品等级的划分是合理的，但其他多种生物碱的含有量却随着直径的增大呈现递减，因此目前延胡索的等级划分仍有待商榷。