甘木通乙酸乙酯提取物对低糖缺氧诱导的神经细胞的保护作用

黄海潮，何 欣，周 捷∗，聂 阳，赵 晋，徐单单

（1.广东食品药品职业学院，广东 广州510520； 2.中山大学肿瘤防治中心，广东 广州510060； 3.广东医科大学，广东 东莞523808）

甘木通为毛茛科丝铁线莲Clematis filamentosaDunn.属，其叶及根入药，有活血通脉降压、镇静安神之功效［1］。甘木通主要分布于岭南地区，为华南珍稀药材，临床用于冠心病、心绞痛、心肌梗死等心血管疾病治疗。目前对于甘木通的研究报道集中于其成分提取以及其治疗心血管疾病作用及机制，对其在神经退行性疾病中的作用鲜见报道。

缺血性脑卒中又称为脑梗死，其患病率、死亡率、复发率、致残率高［2］。中医学关于脑梗死主要病位证素分析结合肝阳上亢证、风火闭窍证、痰火闭窍证等病证分析［3］，而甘木通可用于肝经有热、肝阳上亢、脉络瘀阻等相关疾病治疗前期实验研究［4］表明，甘木通能有效降低氧化应激引起的神经损伤，提示其在神经退行性疾病中的潜在治疗作用，设想其对于脑中风防治有一定的作用。

缺血性脑卒中发病机制为血管堵塞造成脑血流量减少，导致脑组织缺血缺氧，引起组织损伤。本研究通过模拟脑缺血病理生理发展过程，以PC12细胞建立体外缺血性中风的细胞模型，研究甘木通乙酸乙酯提取物（ethyl acetate extract fromClematis filamentosaDunn.EAECFD） 对缺血性中风的影响及作用机制。

1 材料

1.1 细胞株 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12细胞，中国医学科学院上海细胞研究所）。

1.2 药物与试剂 甘木通（批号120618，广东康美药业股份有限公司），经广东食品药品职业学院聂阳副主任药师鉴定为正品；DMEM 培养基、马血清（美国Gibco 公司）；胎牛血清（FBS，批号140313，杭州四季青生物工程材料有限公司）；胰蛋白酶（批号2014B015，美国Amresco 公司）；CCK-8 试剂盒［批号GH802，东仁化学科技（上海） 有限公司］；Triton-X、二甲基亚砜（DMSO） （美国Sigma公司）；PBS （pH ＝7.2，杭州吉诺生物医药技术有限公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA） 试剂盒（南京建成生物工程研究所）；BCA 法蛋白定量试剂盒、AnnexinⅤ-FITC／PI 细胞凋亡检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1） （上海碧云天生物技术有限公司）；B 淋巴细胞瘤-2 蛋白（Bcl-2）、Bcl-2相关X 蛋白（Bax）、β-actin、活化型半胱天冬酶-3（cleaved caspase-3） （美国CST 公司）；其他试剂均为分析纯。

1.3 仪器 311 型细胞培养箱、Sorvall ST 40 台式离心机（美国Thermo 公司）；DMIL 荧光倒置显微镜（德国Leica 公司）；Microplate Reader 酶标仪（美国Bio-Tek 公司）；BD FACS Verse 流式细胞仪（美国BD 公司）。

2 方法

2.1 甘木通乙酸乙酯提取物制备 取甘木通干燥粉碎，过30 目筛，参考文献［5］ 进行初提取，得初提液，蒸干；用乙酸乙酯再提取，大孔树脂纯化提取液，得洗脱液并干燥至恒定质量，提取物得率为1.01%；所得提取物用DMEM 培养液超声溶解，经无菌滤膜过滤备用。

2.2 细胞培养 PC12 细胞用含有10% FBS 和5%马血清的DMEM 培养基（pH＝7.4） 培养，放置于培养条件为95%空气、5% CO2、37 ℃细胞培养箱中。培养24 h 换液1 次，待细胞生长覆盖约至80%，用胰酶消化传代，培养于培养板或培养瓶内贴壁待用，于实验前12 h 更换成无血清低糖DMEM 培养基。

2.3 缺氧细胞模型构建 取实验待用细胞，根据参考文献［6］ 方法模拟脑中风缺氧复氧模型。将细胞置于95% N2、5% CO2、37 ℃密闭容器中，培养0.5、1、2、4、8、12、24 h；再将细胞置于37 ℃、饱和湿度、95% 空气、5% CO2细胞培养箱中继续培养0.5 h；然后加入10 μL CCK-8 检测试剂，37 ℃温育2 h，同时设置正常细胞对照组，酶标仪测定450 nm 处吸光度（OD）。细胞存活率＝ （OD实验组／OD对照组） ×100%。根据试验结果选择合适的缺氧时间制作缺氧模型。

2.4 甘木通乙酸乙酯提取物对缺氧PC12 细胞活性的影响 取实验待用细胞，根据前期实验结果［4］选择提取物浓度，分为对照组，模型组（缺氧4 h），甘木通提取物高、中、低剂量组（100、50、25 μg／mL），阳性对照组（尼莫地平）。通过CCK-8检测细胞存活率，酶标仪测定450 nm 处吸光度（OD），计算细胞存活率。

2.5 甘木通乙酸乙酯提取物对缺氧PC12 细胞LDH 漏出的影响 根据“2.4” 项下实验分组处理细胞，根据LDH 试剂盒操作说明处理细胞，并测定各组细 胞吸光 度 （OD）。LDH 漏出率＝（OD实验组／OD模型组） ×100%。

2.6 甘木通乙酸乙酯提取物对缺氧PC12 细胞凋亡的影响 将PC12 细胞接种于6 孔板中，按“2.4” 项下分组处理细胞，小心吸去原培养液，用PBS 轻轻冲洗，胰酶消化，收集细胞悬液，以1 000 r／min离心10 min，弃去上清，根据试剂盒提供的步骤进行Annexin V-FITC／PI 染色，流式细胞仪检测不同分组PC12 细胞的凋亡率。将PC12 细胞接种于6 孔板中，小心吸去原培养液后，用PBS洗涤后，加入4%多聚甲醛固定15 min 后，PBS 冲洗，Hoechst 33258 染色，在荧光显微镜下观察细胞凋亡形态。

2.7 甘木通乙酸乙酯提取物对缺氧PC12 细胞线粒体膜电位的影响 按“2.4” 项下分组处理后，收集细胞制成细胞悬液，调节细胞数至2×105个，根据试剂盒说明操作，染色，采用流式细胞仪检测。

2.8 甘木通乙酸乙酯提取物对缺氧PC12 细胞凋亡蛋白表达的影响 将PC12 细胞接种于6 孔板中，按“2.4” 项下分组处理后，用冰冷的PBS 冲洗2 次，收集细胞并冰冻裂解，12 000 r／min 离心15 min 去除杂质，吸取上清液，BCA 法测定蛋白量。用含12% SDS-PAGE 胶分离总蛋白，然后转移PVDF 膜 上，5% BSA 封 闭90 min，加入一 抗（Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3），冰冻孵育过夜。洗膜后，加入二抗，37 ℃孵育1 h，再洗1 遍，观察各蛋白表达量并与内参（β-actin） 作比较。

2.9 甘木通乙酸乙酯提取物对缺氧PC12 细胞SOD、MDA 水平的影响 将PC12 细胞接种于24孔板中，按“2.4” 项下分组处理后，去除原培养液，根据参考文献［7］方法处理后，按说明书测定细胞中SOD 和MDA 水平。

2.10 统计学分析 利用SPSS 21.0 统计软件进行统计分析，数据以（） 表示，多组间比较采用方差分析，以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 不同缺氧时间对PC12 细胞存活率的影响 随着缺氧时间的增加，PC12 细胞存活率逐渐下降。与对照组（缺氧0 h） 比较，PC12 细胞缺氧2～24 h 细胞存活率降低（P＜0.05，P＜0.01），见图1。本实验缺氧造模时间设为4 h。见图1。

3.2 甘木通乙酸乙酯提取物对缺氧PC12 细胞存活率的影响 与模型组比较，甘木通乙酸乙酯提取物提高细胞存活率（P＜0.05，P＜0.01），见图2。

3.3 甘木通乙酸乙酯提取物对缺氧PC12 细胞LDH 漏出的影响 在缺氧条件下，细胞中LDH 漏出率增加（P＜0.01）。与模型组比较，甘木通乙酸乙酯提取物能降低 LDH 漏出率 （P＜0.05，P＜0.01），表明甘木通乙酸乙酯提取物对缺氧诱导的细胞损伤有保护作用。见图3。

图1 不同缺氧时间对PC12 细胞存活率的影响（n＝6）Fig.1 Effects of different hypoxic time on PC12 cell survival rate （n＝6）

图2 甘木通乙酸乙酯提取物对缺氧PC12 细胞存活的影响（n＝6）Fig.2 Effects of EAECFD on the survival of hypoxic PC12 Cells （n＝6）

3.4 甘木通乙酸乙酯提取物对缺氧PC12 细胞凋亡的影响 流式细胞术结果显示，对照组细胞凋亡很少，凋亡率为6.8%；模型组细胞凋亡数量增多，凋亡率为46.3%，并且有部分细胞坏死；阳性对照组细胞凋亡率为11.3%；不同质量浓度甘木通乙酸乙酯提取物作用，凋亡细胞比例逐渐减少，细胞凋亡率分别为39.6%、27.8%、15.5%，见图4。Hoechst 33258 染色结果显示，对照组细胞核形态完整，基本没有凋亡细胞少；模型组出现多处亮色荧光，表明细胞凋亡形态明显；阳性对照组细胞基本趋于正常；甘木通乙酸乙酯提取物组正常细胞增多，见图5。

图5 Hoechst 33258 染色观察各组细胞凋亡细胞形态（×400）Fig.5 Apoptotic cell morphology by Hoechst 33258 staining （×400）

3.5 甘木通乙酸乙酯提取物对缺氧PC12 细胞线粒体膜电位的影响 与对照组比较，模型组细胞的线粒体膜电位下降（P＜0.01）；与模型组比较，甘木通乙酸乙酯提取物中、高剂量组及阳性对照组线粒体膜电位升高（P＜0.05，P＜0.01）。见图6。

3.6 甘木通乙酸乙酯提取物对缺氧PC12 细胞凋亡蛋白表达的影响 Bcl-2、Bax 蛋白表达影响线粒体膜的通透性，从而启动线粒体凋亡信号通路［8］。cleaved caspase-3 是caspase-3 的活化形式，其决定细胞凋亡程度［9］。与对照组比较，模型组Bcl-2 蛋白表达降低，Bax／Bcl-2 比例及Bax、cleaved caspase-3 蛋白表达增加（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，甘木通乙酸乙酯提取物组（中、高剂量） Bcl-2 蛋白表达增加，Bax／Bcl-2 比例及Bax、cleaved caspase-3蛋白表达降低（P＜0.05，P＜0.01），见表1、图7。

图6 甘木通乙酸乙酯提取物对缺氧PC12 细胞线粒体膜电位的影响（n＝3）Fig.6 Effects of EAECFD on mitochondrial membrane potential in hypoxic PC12 cells （n＝3）

表1 甘木通乙酸乙酯提取物对缺氧PC12 细胞凋亡蛋白表达的影响（%，， n＝3）Tab.1 Effects of EAECFD on the expression of Bax，Bcl-2 and cleaved caspase-3 in hypoxic PC12 cells （%，， n＝3）

表1 甘木通乙酸乙酯提取物对缺氧PC12 细胞凋亡蛋白表达的影响（%，， n＝3）Tab.1 Effects of EAECFD on the expression of Bax，Bcl-2 and cleaved caspase-3 in hypoxic PC12 cells （%，， n＝3）

注：与对照组相比，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

图7 Western blot 检测凋亡蛋白表达Fig.7 Apoptosis-related proteins expression by Western blot

3.7 甘木通乙酸乙酯提取物对缺氧PC12 细胞SOD、MDA 水平的影响 与对照组比较，模型组SOD 水平降低，MDA 水平升高（P＜0.01）；与模型组比较，甘木通乙酸乙酯提取物组SOD 水平升高，MDA 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），见图8。

4 讨论

图8 甘木通乙酸乙酯提取物对缺氧PC12 细胞SOD、MDA 水平的影响（n＝6）Fig.8 Effects of EAECFD on SOD，MDA levels of hypoxic PC12 cells （n＝6）

近年来研究［10］表明，脑中风的病理生理机制为各种因素引起的神经元的凋亡以及坏死，导致神经系统出现不可逆的损伤，从而使中风加深加重。本实验根据缺血性中风导致神经系统的缺氧／复氧的病理机制，建立缺血性中风的细胞模型。该模型更能真实的模拟缺血缺氧的病理生理特征，减少实验的影响因素［6］。

流式细胞仪检查细胞凋亡，对PC12 细胞凋亡进行分析。在甘木通乙酸乙酯提取物的作用下，细胞凋亡数明显减少，表明甘木通乙酸乙酯提取物可以有效抑制缺氧引起的细胞凋亡。并且Hoechst 33258 染色结果进一步证明甘木通乙酸乙酯提取物对缺氧细胞的保护作用。

JC-1 在细胞中以单体和聚合体形式存在，在正常细胞，由于线粒体的极性，JC-1 被摄入进入线粒体形成多聚体，发出红色荧光；而在凋亡的细胞中，细胞线粒体极性下降，JC-1 从线粒体释放至胞质，以单体形式存在，呈绿色荧光；通过不同荧光比值，检测线粒体的相对膜电位。本实验中，模型组中的线粒体膜电位明显下降，而甘木通乙酸乙酯提取物可以明显提高线粒体膜电位 （P＜0.05），提示甘木通乙酸乙酯提取物的保护作用可能与影响线粒体膜电位相关。

研究显示Bcl-2 和caspase 蛋白家族均参与了脑缺血线粒体凋亡途径［11］。2 种蛋白直接参与释放细胞色素C （CytC） 的线粒体膜通透性转换孔的调节。Bcl-2 蛋白家族分为促凋亡蛋白（Bax、Bad等） 和抑制凋亡蛋白（Bcl-2），2 种功能相反的蛋白主要通过影响线粒体的膜电位以及CytC 水平影响细胞凋亡进程，2 者表达高低直接反映细胞凋亡情况［12］。caspase 蛋白家族在脑缺血活化明显［13］。细胞中Bcl-2 低表达，可引起线粒体相关的细胞核固缩和DNA 裂解以及Cyt C 从线粒体释放，导致活化型caspase-3 （cleaved caspase-3） 出现，表明细胞处于凋亡状态。蛋白印迹结果显示，模型组Bax、cleaved caspase-3 表达增加，Bcl-2 表达明显减少，说明细胞凋亡损伤明显；甘木通乙酸乙酯提取物作用 后，Bcl-2 表达增 加，Bax、cleaved caspase-3 表达逐渐减少，说明甘木通乙酸乙酯提取物可以抑制缺氧诱导的细胞凋亡，并且其作用可能与线粒体凋亡途径相关。

细胞凋亡开始时，细胞内的谷胱甘肽水平下降以及活性氧（ROS） 的升高，可引起烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原态NADH 和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸水平下降，并引起胞内O2-聚集，影响线粒体膜电位，最终导致细胞凋亡［14］。MDA 是O2-引起的脂质过氧化产物，其可以反映O2-对细胞的损失；而SOD 可有效清除细胞内O2-，保护细胞。本研究结果显示甘木通乙酸乙酯提取物可有效降低缺氧诱导PC12 细胞MDA 水平，提高SOD 水平，表明甘木通乙酸乙酯提取物能有效减少PC12 细胞氧化损伤，起到保护细胞的作用。

综上所述，甘木通乙酸乙酯提取物具有神经保护作用并且其作用方式可能是通过提高细胞内SOD 水平，减少氧自由基对细胞的损害，影响线粒体凋亡途径，从而抑制缺氧诱导的细胞凋亡，保护细胞。研究表明，甘木通主要药效成分为多种黄酮苷［15］，其神经保护作用可能与甘木通提取物中的黄酮苷密切相关，本课题进一步的研究将基于此，寻找突破口，全面深入探讨甘木通对缺血性中风的作用以及作用机制研究。