老年肺腺癌胸腔积液中Survivin和ALK蛋白表达水平及其与临床病理特征的相关性

翟丽丽 张冰 徐丹丹 郭家鼎 陈文静

(1齐齐哈尔市第一医院，黑龙江 齐齐哈尔 161000；2齐齐哈尔市中医院)

肺癌是一种恶性度极高的疾病，发病率和死亡率均居恶性肿瘤首位。我国每年的肺癌新增病例约为65万，占全球新发病例总数的三分之一〔1〕。肺癌又称“老年癌”，即老年人罹患肺癌概率更大。非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌的一种病理分型，其中50%左右的NSCLC患者属于肺腺癌亚型〔2〕。以前对于肺腺癌的治疗一般是根据指南选择合适的药物进行化疗。随着科学技术的发展，精准医疗的概念逐渐形成，治疗进入到个体化分子靶向阶段。部分肺腺癌中存在间变性淋巴瘤激酶 (ALK)基因变异现象，主要是由于ALK基因发生重排或与其他基因融合〔3〕。而生存素(Survivin)是近年来发现的凋亡抑制蛋白(IAPs)家族中的一员，具有抑制肿瘤细胞凋亡，同时促进其有丝分裂的作用，在肿瘤细胞中存在过度表达的现象〔4〕。本研究通过免疫组化(SP)法检测Survivin和ALK在老年肺腺癌患者胸腔积液中的表达水平，分析两者与临床病理特征的相关性。

1 资料与方法

1.1研究对象 将2017年2月至2019年2月于齐齐哈尔市第一医院呼吸科确诊的老年胸腺癌伴随胸腔积液患者52例纳入观察组，纳入标准：①经病理学/细胞学证实为原发性肺腺癌患者；②经影像学检查存在胸腔积液患者；③年龄≥60岁；④未经胸膜腔内化疗、局部放疗及免疫治疗的患者；⑤预计生存期≥2 个月；⑥未合并严重心脑血管疾病、肝肾功能障碍者。排除标准：①不符合上述标准者；②存在胸部积液引流的绝对禁忌证；③依从性差或拒不配合检查者。年龄60～80岁，中位年龄72岁。根据国际肺癌研究协会(IASLC)2009年第7版分期标准分为〔5〕：Ⅰ期中Ⅰa 5例，Ⅰb 7例，Ⅱ期中Ⅱa 14例，Ⅱb 13例、Ⅲ 期中Ⅲa 10例，Ⅲb3例。所有病例未见远端转移。

另择同期确诊为良性疾病伴随胸腔积液患者48例纳入对照组，男25例，女23例，年龄60～78岁，中位年龄70岁。其中<70岁20例，≥70岁28例。其中30例为肺结核所致胸腔积水，18例为肺炎所致胸腔积水。有吸烟史患者20例，无吸烟史患者28例。患者均具有完整的临床病理资料并完成所有的术后随访，两组一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。本研究已通过医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2试剂与仪器 兔抗人Survivin多克隆抗体(Abcam公司，英国)，兔抗人ALK(D5F3)单克隆抗体(CST公司，美国)，SP二抗检测试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色剂(均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，中国)，磷酸盐缓冲液(PBS)、枸橼酸缓冲液(均为实验室自制)。低温高速离心机(Eppendorf，USA)、轮转切片机(LEICA，Germany)、恒温箱(上海跃进医疗器械厂，中国)、移液枪(Eppendorf，USA)、Motic Med 6.0数码医学图像分析系统(北京麦克奥迪图像技术有限公司，中国)。

1.3样本制备 经胸腔闭式引流术或术中直接提取获得胸腔积液，每例200 ml。将得到的胸腔积液于30 min内分装至50 ml离心管，配平后置于低温离心机内离心。设定条件：温度为4℃，转速3 000 r/min，离心半径14 cm，离心时间10 min。完毕后小心弃去上清液，得到胸腔积液沉渣。加入浓度为10%的中性甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，切成厚度为4 μm的连续切片备用。

1.4SP法 取制备好的切片，放置已预热至60℃的恒温箱中，加热20 min，使切片紧密黏附。经二甲苯常规脱蜡、梯度酒精脱水后，将切片转移至蒸馏水中浸泡待用。弃去蒸馏水，于37℃下用浓度3%的H2O2溶液孵育切片10 min，以灭活内源性的过氧化物酶。PBS冲洗3次，转移至放有0.01 mol/L枸橼酸缓冲液(pH6.0)的烧杯中煮沸15～20 min，室温下冷却20 min，而后采用冷毛巾法加快冷却至室温，以修复抗原。PBS冲洗3次，于37℃下用工作液封闭血清10 min，滴加一抗(兔抗人Survivin多克隆抗体或兔抗人ALK单克隆抗体)，4℃冰箱孵育过夜。PBS冲洗三次，滴加二抗，室温下孵育30 min。PBS冲洗三次，用新鲜配置的DAB溶液显色，用蒸馏水冲洗，用苏木素复染30 s，反蓝，用蒸馏水冲洗后，常规脱水、透明、干燥后封片。用自制的PBS替代一抗作为阴性对照，全过程由同一高年资的医生完成，将人为误差降到最小。

1.5结果判定 Survivin阳性细胞定义〔6〕：细胞质和(或)细胞核出现明显的棕黄色颗粒。每个组织切片先于100倍物镜下随机选择5个表达最密区，后于400倍物镜下计算阳性细胞数百分比，对阳性细胞比例和染色强度进行评价。染色强度定义：无明显着色计0分，表示阴性；淡黄色颗粒计1分，表示弱阳性；黄色颗粒计2分，表示中阳性；棕黄色颗粒记为3分，表示强阳性。对视野中的阳性细胞和全部细胞分别计数，计算阳性细胞比例。以染色强度与阳性细胞比例的乘积作为最终评分，积分≥1者认为表达阳性，<1者认为表达阴性。

ALK阳性细胞定义〔7〕：细胞质内出现棕褐色颗粒。采用二分类计分法，细胞质内存在棕褐色颗粒即为阳性，否则即为阴性。

1.6统计学方法 采用SPSS23.0软件进行t检验，χ2检验或校正χ2检验，秩和检验，Spearman 相关分析。

2 结 果

2.1Survivin蛋白和ALK蛋白在胸腔积液中的表达 染料可选择性的将Survivin和ALK染成棕黄色颗粒或棕褐色颗粒，从而定位该蛋白。结果可见，Survivin蛋白在观察组和对照组胸腔积液细胞中部分表达，且呈无规律分布，主要分布于细胞质中，少数分布于细胞核内；ALK蛋白只在观察组胸腔积液细胞中表达，且只分布于细胞质中，细胞核内未见染色，见图1和图2。Survivin蛋白在观察组中的阳性表达率(73.08%)明显高于对照组(26.92%，χ2=43.359，P=0.000)；ALK蛋白在观察组中的阳性表达率为7.69%，在对照组的阳性表达率0.00%，差异无统计学意义(χ2=2.104，P=0.147)。

图1 两组Survivin蛋白(SP法，×100)

2.2Survivin、ALK蛋白表达与临床病理特征关系 Survivin蛋白表达与临床分期、肿瘤直径、淋巴转移情况、生存状态有关(P<0.05)；与性别、年龄、分化程度、吸烟史无关(P>0.05)。ALK蛋白表达与临床分期和生存状态有关(P<0.05)；与性别、年龄、分化程度、肿瘤最大直径、淋巴转移情况、吸烟史无关(P>0.05)，见表1。

图2 两组ALK蛋白表达(SP法，×100)

表1 Survivin、ALK蛋白在不同临床病理特征中的表达〔n(%)〕

2.3相关性分析 Survivin蛋白与ALK蛋白表达不相关(P>0.05)，见表2。

表2 Survivin蛋白与ALK蛋白表达的相关性

3 讨 论

肺癌诊断的金标准是病理检查，通过穿刺活检或直接术中获得病理组织或细胞样本是诊断的关键。然而老年肺腺癌患者生理功能减退，免疫力低下，且容易合并多种慢性病，多数患者在初次就诊时肺功能已低于正常水平，无法进行手术治疗。穿刺活检是一种创伤取样的手段，容易造成气胸、血胸、胸膜反应、压缩性肺不张等不良反应，因此以最小的伤害获取可信度最高的病理样本是肺肿瘤诊断中的重要环节〔8〕。胸腔积液是肺腺癌患者常见并发症，且随着病情进展逐渐加重。恶性胸腔积液中的肿瘤细胞在癌细胞浸润、转移等过程中起着重要作用，同时也是病理诊断中的重要依据〔9〕。对于无法进行手术或不宜穿刺活检的患者，获取胸腔积液的操作简单，同时也是缓解其临床症状一种手段，具有良好的可行性。

Survivin蛋白在正常的终末分化组织中几乎不表达，生理状态下仅表达于成人分泌期子宫内膜、胎盘、睾丸、胸腺及胚胎中，病理状态下广泛分布于人类各种恶性肿瘤组织中〔10〕。自1997年发现至今，Survivin蛋白一直是肿瘤治疗的作用靶点。本研究结果表明Survivin蛋白在老年肺腺癌胸腔积液中是异常表达的。免疫组化结果显示，Survivin蛋白在细胞核和细胞质中均有分布，这可能与其抑制肿瘤细胞凋亡，同时促进其有丝分裂的功能有关。当其位于细胞核线粒体中时，可以抑制细胞色素C通路，保护细胞免于凋亡；当其位于胞质内时，直接作用于终末效应器半胱天冬氨酸酶(caspase)-3、caspase-7等，抑制细胞凋亡；因Survivin的表达具有细胞周期性，只在细胞周期G2/M期特异性表达，因此可以促进肿瘤细胞的有丝分裂。Wu等〔11〕研究表明Survivin阴性表达的NSCLC患者其中位生存期要明显高于阳性表达着，Survivin表达情况是NSCLC预后评估的独立影响因子。马建梅等〔12〕研究认为Survivin蛋白是病情进展及临床分期的评估指标之一。而肿瘤的最大直径、淋巴转移情况均与临床分期密切相关，因此本研究结论与前人研究〔11,12〕相符。

ALK融合基因是在肺癌的发生、发展、转移的重要危险因素。最新指南中明确建议进展期NSCLC患者尽可能地确定临床亚型，均应进行内皮生长因子EGFR及ALK融合基因筛查，可以更好地开展治疗。ALK融合基因阳性表达是肺腺癌的一个独立分子类型，具有较为独特的临床病理特征。国外研究〔13〕报道，ALK融合基因在NSCLC中的阳性率为4.9%。ALK融合基因的危险因素包括：不吸烟、年轻、男性、腺癌。国内研究〔14〕显示，ALK融合基因在NSCLC中的阳性率为4.2%；在腺癌中的融合率升至10%。本研究与上述研究结果一致。本研究中研究对象为老年肺腺癌患者，对于年龄已做了设定，所以未显示出ALK表达与年龄的相关性。再者因为阳性样本量过小，只有4例，所以在性别、分化程度、肿瘤最大直径、淋巴转移情况、吸烟史等方面的差异性未曾显现。应扩大样本进一步研究。Survivin蛋白是通过抑制效应性蛋白酶实现抗凋亡作用的，其合成还具有细胞周期性，从而实现促增殖的作用；而ALK蛋白是一种络氨酸酶，两者并不存在通路上下游的关系，而是从两个不同的机制促进肺腺癌细胞的异常增殖、分化过程，因此不存在表达相关性〔15〕。