基于山梨酸钾衍生多孔碳修饰电极用于橙皮素检测

李可欣，陈泇冰，潘永全*

(1.重庆医科大学 实验动物中心，重庆 400016；2.湖北民族大学 化学与环境工程学院，湖北 恩施 445000)

橙皮素(Hesperetin，HSP)是一种芸香科柑橘属的二氢黄酮类天然产物，常见于柑橘类植物的果皮及果肉中[1-2]。橙皮素结构中的酮羰基、醚基、甲氧基及酚羟基使得其具有一定的药理活性，如降血糖、降血脂、降血压、抗炎、抗菌、抗肿瘤及心血管保护等作用[3-9]，常被用于药品及食品添加剂以发挥其药理作用。近年来，已有文献报道橙皮素具有潜在的抗高尿酸血症活性，主要机制是橙皮素作为一种天然黄嘌呤氧化酶抑制剂，可通过抑制黄嘌呤氧化酶和黄嘌呤脱氢酶的活性，从而减少尿酸生成，对于高尿酸血症具有一定的防治作用[10]。因此，亟待开发一种高效快速的橙皮素定量检测方法。常见的橙皮素含量测定方法有高效液相色谱法[11]、高效液相色谱-质谱联用法[12]、毛细管电泳法[13]、紫外分光光度法[14]及荧光分析法[15]。相比于上述方法，电化学法具有操作简便、灵敏度高、选择性好、前处理简单等优点，可应用于橙皮素的快速及高灵敏度检测[16]。目前，运用电化学法检测橙皮素的报道相对较少，利用电化学法研究橙皮素在电极表面的反应机理及痕量测定具有一定的研究意义和应用前景。

多孔碳常被用作电极修饰材料，其通常通过硬模板法制备而成[17]。然而，近年来报道采用有机盐类热解制备多孔碳的研究引起了广泛关注。如Zhu等[18]通过将柠檬酸铁和NH4Cl混合，利用柠檬酸铁的有机部分作为碳源，NH4Cl既作氮源又作致孔剂，制备了一系列N掺杂的多孔碳并用于超级电容器的制作；Sun等[19]通过将NaCl及谷氨酸钠混合，利用NaCl作为模板，谷氨酸钠作为碳源，制作了分级互连的多孔碳材料，并将其应用于锌离子空气电池；Sun等[20]通过常见的两步法利用海藻酸钾热解，制备出一种三维互连的多孔碳，由于其大的比表面积及丰富的含氧官能团，从而在超级电容器研究中表现出优异的电化学性能。然而，利用有机盐类通过一步热解方法制备的多孔碳多用于超级电容器及锂离子电池方面[21]，鲜有在电化学分析方面的应用报道。由于多孔碳具有较大的比表面积、多孔特性及优异的电化学性能，使得其在电化学分析领域具有潜在的应用价值。

山梨酸钾(PS)作为一种常见的防腐剂，具有低毒性、吸湿性及易氧化性[22]。基于其防腐、安全、低毒、稳定的特点，已被广泛应用于各类食品保鲜。然而，山梨酸钾在吸潮和氧化后易变色及变质，废弃的山梨酸钾不再具有防腐性能[23]。因此，使用山梨酸钾通过一步热解法制备多孔碳，不仅能达到资源循环利用、环境保护的目的，同时也是一种简便快速制备多孔碳的方法。

本文利用山梨酸钾通过一步热解法制备出三维互连的多孔碳材料，构建了一种基于其衍生的多孔碳修饰电极(PSIPC-900/GCE)，并利用CV及EIS研究了其电化学特性。考察了橙皮素在该修饰电极上的行为，通过DPV对其含量进行测定以及对实际样品进行检测。本课题组前期工作显示橙皮素对高尿酸血症具有一定治疗作用，并通过动物实验考察了其药理机制。本文从橙皮素的酚羟基及甲氧基结构出发，进一步考察了其在PSIPC-900/GCE的电化学行为，并将PSIPC-900/GCE用于橙皮素的测定。本文提出的电化学传感器方法操作简便、灵敏度高，具有一定的抗干扰及稳定性，为橙皮素的检测提供了一种新思路，具有一定的研究价值。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI-660e电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)；Hitachi S4800冷场发射扫描电子显微镜(日本日立公司)；Shimadzu XRD-7000 X射线衍射仪(日本岛津公司)；Tecnai G20 透射电子显微镜(美国FEI公司)；EscaLab 250Xi X射线光电子能谱仪(美国赛默飞世尔科技公司)；Thermo ESCALAB 250XI光电子能谱仪(美国赛默飞世尔科技)；Quantachrome Autosorb iQ全自动气体吸附仪(美国康塔仪器公司)；LabRAM HR800拉曼光谱仪(法国Horiba Jobin Yvon)；KH2200E型超声波(昆山禾创超声仪器有限公司)。

N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、无水乙醇、山梨酸钾(分析纯，上海阿拉丁生化科技有限公司)；抗坏血酸、尿酸、葡萄糖、鸟嘌呤(分析纯，国药试剂有限公司)；橙皮素(HSP，分析纯，美国Sigma-Aldrich公司)；PBS溶液以0.1 mol/L的KH2PO4和0.1 mol/L的Na2HPO4按不同比例配制，实验用水均为超纯水。

SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠(200～220 g)9只，由重庆医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号为SCXK(渝)-2017-0001。在室温 20～25 ℃ ，相对湿度( 50±5) % 的条件下饲养，自由进食、进水。取尿液前禁食12 h，自由饮水。

1.2 实验方法

取4 g山梨酸钾置于刚玉坩埚，并将其置于管式炉中，于氮气氛围下以10 ℃/min升温至900 ℃，保温3 h，冷却至室温后取出，得到黑色粉末样品。将黑色粉末样品置于0.1 mol/L盐酸中，搅拌12 h以除去残留的金属及金属盐。使用水及乙醇各洗涤3次，置于60 ℃烘箱干燥12 h。得到山梨酸钾衍生的多孔碳PSIPC-900。在同样条件下于700 ℃及800 ℃下制备得到黑色粉末样品，记作PSIPC-700和PSIPC-800。

PSIPC-900/GCE的制备如下：取10 mg PSIPC溶于10 mL DMF中，超声3 h得均匀分散的PSIPC分散液。用氧化铝粉末将玻碳电极打磨3 min抛光成镜面，分别置于硝酸(1∶1)、无水乙醇和水中各超声3 min，在氮气流下吹干，用移液枪取5 μL滴涂在打磨抛光的玻碳电极表面，滴涂后的电极置于45 ℃烘箱干燥，修饰电极记为PSIPC-900/GCE。

所有的电化学检测均在室温下用标准的三电极体系进行，GCE和PSIPC-900/GCE作为工作电极，铂电极作为辅助电极，甘汞电极作为参比电极。CV电化学测试窗口为0.2～0.9 V，扫速为100 mV/s；DPV电化学测试窗口为0.2～0.9 V，扫速为100 mV/s，脉冲振幅为25 mV，脉冲宽度为0.05 s，平衡时间为5 s，脉冲频率为10 Hz。

2 结果与讨论

2.1 PSIPC的SEM、TEM、XRD、XPS、TGA及N2吸附-脱附表征

采用扫描电子显微镜(SEM)对PSIPC的形貌进行表征。图1A、B、C分别为PSIPC-700、PSIPC-800及PSIPC-900的SEM图。如图所示，不同温度下制备的多孔碳材料均具有较多孔道，且孔道分散均匀。随着温度增加，在其表面形成了更多微孔，同时由于碳壁破裂，其大孔孔径也随之增大。PSIPC表面除具有较多互相连接的大孔，还具有较多的微孔，这种独特的孔道结构在增加其比表面积的同时，还能提供更大的活性位点和缩短离子扩散距离，从而更有利于电化学信号的传输。

图1 不同温度下3种PSIPCs的扫描电镜图Fig.1 SEM images of three PSIPCs at different temperaturesA.PSIPC-700，B.PSIPC-800，C.PSIPC-900

图2为PSIPC-900的透射电子显微镜(TEM)图。如图2A所示，PSIPC-900由互相连接的多孔形成三维孔状结构，其孔径约为200 nm。图2B为PSIPC-900的高分辨透射电镜图(HRTEM)，显示其表面具有较多微孔及介孔，这主要归因于活泼金属K在气化过程中对碳材料表面产生刻蚀作用，同时有机部分热解过程中产生的CO2及CO也为微孔及介孔的产生做出一定贡献。图2C为PSIPC-900的选区电子衍射图(SAED)，图中显示有两个微弱的衍射环，这可归因于碳的(002)及(100)面衍射。

图2 PSIPC-900的透射电镜图(A)、高分辨透射电镜图(B)及选区电子衍射图(C)Fig.2 TEM(A)，HRTEM(B) and SAED(C) images of PSIPC-900

图3A为PSIPC-900的X-射线衍射图谱(XRD)。如图所示，在2θ=24°及44°处出现两个较宽的衍射峰，这可归属于石墨的(002)及(100)晶面[24]，表明在900 ℃下制备的多孔碳材料PSIPC-900已完全碳化，证明已发生了高温下的碳化过程。

图3 PSIPC-900的XRD图谱(A)、X射线光电子能谱(B)及C1s高分辨率图谱(C)Fig.3 XRD spectra(A),XPS spectrum(B) and high-resolution XPS spectra(C) of C1s for the PSIPC-900 insert:XRD spectrum of potassium sorbate

图4 山梨酸钾的热重分析曲线Fig.4 Thermogravimetric analysis curve of potassium sorbate

采用热重分析(TGA)考察了山梨酸钾的热分解过程(见图4)，如图所示，TGA 曲线在270～500 ℃及750～850 ℃出现两个失重平台。第一段失重主要由于山梨酸钾的分解及碳酸钾的形成；第二段失重为碳酸钾的分解，碳酸钾分解过程为K2CO3→ K2O+CO2，K2O+C → 2K+CO，CO2+C → 2CO[25-26]。其分解过程产生的金属K及气体CO、CO2为材料的微孔和介孔的产生做出了贡献，此结果与前述分析一致。

图5为PSIPC-900的N2吸附-脱附曲线图(A)及孔径分布分析图(B)。如图所示，在相对压强0 ～0.4时吸附曲线与脱附曲线相重合，表现出明显的Ⅰ/Ⅳ型吸附等温线，表明材料中含有微孔及介孔。在孔径分布曲线(图5B)中，可以观察到在1.5、4.3、8.5、13.4、21.0、31.7 nm处的6个峰，这表明材料有微孔及介孔，其比表面积为1 024.3 m2,巨大的比表面积及丰富的孔道为HSP的吸附提供了更多的活性位点。

图5 PSIPC-900的氮气吸附-脱附图(A)及孔径分布曲线(B)Fig.5 N2 adsorption and desorption isotherm(A) and distribution of pore size(B) for PSIPC-900

图6 不同电极在5 mmol/L Fe[(CN)6]3-/4-存在下0.1 mol/L KCl溶液中的EIS图Fig.6 EIS plots obtained of different electrodes for 5 mmol/L Fe[(CN)6]3-/4- in 0.1 mol/L KCl

2.2 修饰电极的电化学表征

考察了PSIPC-900/GCE在5 mmol/L Fe[(CN)6]3-/4-存在下0.1 mol/L KCl的EIS图(见图6)。由于EIS曲线由高频区的半圆及低频区的直线组成，它们分别代表了电子转移过程及扩散过程，因此EIS图的半圆直径可表明电极表面电子转移电阻的大小。如图所示，GCE的半圆直径明显大于修饰电极PSIPC-900/GCE，表明PSIPC-900/GCE具有更高的电子传输能力。这主要归因于多孔碳PSIPC-900材料的高导电性、较大的比表面积及丰富的孔道分布。

2.3 HSP在修饰电极上的电化学行为

采用CV及DPV考察了HSP在修饰电极PSIPC-900/GCE的电化学行为(图7)。结果显示，对单独的0.1 mol/L PBS(pH 2.0)溶液进行CV扫描时(曲线c)，PSIPC-900/GCE中未出现氧化还原峰，表明电极在此电位窗口下稳定；曲线a和b为10 μmol/L HSP存在于0.1 mol/L PBS(pH 2.0)时,PSIPC-900/GCE和GCE的CV曲线，可观察到在526 mV/548 mV处出现1对氧化还原峰(p1/p2)，在784 mV(p3)出现1个单独的不可逆氧化峰，且曲线a的氧化峰电流值明显高于曲线b。这主要归因于PSIPC-900多孔碳材料的良好导电性、较大的比表面积及丰富的孔径分布为HSP提供了更多的活性位点。其中，HSP在PSIPC-900/GCE上的电化学反应机理如下：p3氧化峰的产生可能与六元环中的羟基及甲氧基有关，而p1与p2峰的产生可能归因于p3氧化产物的邻位羟基的氧化还原反应(图7C)[16]。图7B为10 μmol/L HSP存在于0.1 mol/L PBS(pH 2.0)时，GCE及PSIPC-900/GCE的DPV曲线，其结果与CV相一致。上述研究结果表明，PSIPC-900可用作高灵敏检测HSP的电极材料。

图7 不同电极在含有10 μmol/L HSP 的0.1 mol/L PBS(pH 2.0)中的CV(A)，DPV(B)图及HSP的电极反应机理(C)Fig.7 CV(A),DPV(B) curves of different electrodes in 0.1 mol/L PBS(pH 2.0) containing 10 μmol/L HSP,and electrode reaction mechanism of HSP in PSIPC-900/GCE(C)a:PSIPC-9/GCE,with 10 μmol/L HSP;b.GCE,with 10 μmol/L HSP;c.PSIPC-9/GCE,without 10 μmol/L HSP

2.4 PSIPC材料热解温度及分散液浓度的影响

采用不同热解温度制备的PSIPC-700、PSIPC-800及PSIPC-900，分别制备成其对应的电极PSIPC-700/GCE、PSIPC-800/GCE及PSIPC-900/GCE，并扫描其在10 μmol/L HSP存在下的DPV图。结果显示，PSIPC-900/GCE的峰电流值明显高于PSIPC-700/GCE和PSIPC-800/GCE，这主要归因于在700 ℃及800 ℃下制备的碳材料表面仍存在一定的K2CO3，相比于PSIPC-900的电化学活性更低，因此选择PSIPC-900作为修饰材料。进一步考察了PSIPC-900分散液不同修饰浓度(0.4、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0 g/L)对10 μmol/L HSP的DPV信号的影响。结果显示，在浓度为1.0 g/L时，其氧化峰电流达到最大，因此选择1.0 g/L作为PSIPC-900分散液的最优修饰浓度。

图8 pH值对10 μmol/L HSP在PSIPC-900/GCE上信号强度的影响Fig.8 Effect of pH value on oxidation peak current of 10 μmol/L HSP on PSIPC-900/GCEinsert：linear fit of pH value and peak potential

2.5 pH值对HSP检测的影响

采用DPV法考察了不同pH值(2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0)对10 μmol/L HSP峰电位信号的影响。结果显示，随着pH值的增加，其峰电位逐渐负移且峰电流值逐渐降低(图8)，因此选择pH 2.0的0.1 mol/L PBS作为最优pH值。研究显示，在此pH范围内，峰电位与pH值呈线性关系，其线性方程为Ep(V)=0.628-0.053 pH(r2=0.999)，斜率值接近理论能斯特斜率值-0.059，表明HSP在该电极上的电化学反应过程质子数与电子数相同。

2.6 扫描速率的影响

2.7 方法的线性范围与检出限

在最优条件下，以DPV法使用PSIPC-900/GCE对不同浓度(0、0.05、0.1、0.4、0.7、1.0、4.0、7.0、10.0、15.0 μmol/L)的HSP标准溶液进行测定，以确定其线性范围及检出限。结果显示，HSP的峰电流值随着其浓度的增加而增加，且 HSP浓度在0.05 ～15.0 μmol/L范围内呈线性关系，线性拟合方程为Ipa=8.293c+2.268(r2=0.999)，灵敏度为116.4 A·mol/L-1·cm-2，检出限为0.021 μmol/L。相比于文献报道的HSP检测方法，本文所构建的电化学传感器具有更高的灵敏度及更宽的检测范围(见表1)。

表1 不同检测方法对HSP检测性能的比较Table 1 Performance comparison of different detection methods for HSP

2.8 方法的重现性、稳定性及选择性

在最优实验条件下，将修饰电极PSIPC-900/GCE放置1个月后，采用DPV法对10 μmol/L HSP进行重新测试，其氧化峰电流变化2.4%，表明电极具有较好稳定性；采用同一根PSIPC-900/GCE修饰电极对10 μmol/L HSP重复测定10次，其电流值的相对标准偏差(RSD)为1.2%，表明电极有较好的重复性。

2.9 实际样品的测定

为了考察PSIPC-900/GCE对实际样品测定的可行性，实验采用DPV法对大鼠尿液进行测定。大鼠尿样处理如下：将9只正常SD大鼠随机分为3组(n=3)，置于代谢笼中，实验前禁食 12 h，自由饮水，并同时收集空白尿液，将其置于离心机中，以13 000 r/min离心10 min除去尿样中的蛋白质，待上清液尿酸浓度稀释至5.0 μmol/L，置于4 ℃条件下备用。采用标准加入法对3种不同浓度(1.0、5.0、10.0 μmol/L)的HSP进行测定，测得回收率分别为96.4%、104%、98.2%，RSD分别为2.1%、4.6%、2.6%，表明 PSIPC-900/GCE可用于实际样品中HSP的测定。

3 结 论

本文以山梨酸钾作为碳源，在900 ℃下通过热解法制备了一种互连多孔碳材料PSIPC-900，通过该多孔碳材料制备成电化学传感器PSIPC-900/GCE，考察了HSP在该修饰电极上的电化学行为。实验结果表明，该修饰电极可用于HSP的高灵敏度测定，且检测范围广。本研究为HSP含量的测试提供了新思路，同时也为HSP对高尿酸血症的后续药理机理研究提供了一种新的检测方法。