柱切换-液相色谱法测定婴儿配方奶粉中4种雌激素

俞华芬

(余杭区农产品质量安全检验检测站，杭州311100)

雌二醇、己烷雌酚、己烯雌酚、己二烯雌酚是结构相近的人工合成雌激素，均含有酚羟基，为弱酸性化合物。由于其致癌作用[1]，欧盟(96/23/EC)已禁止使用，美国和加拿大则限量使用，我国农业部在2002年第193号公告里明令禁止性激素和具有雌激素作用的物质在食品动物中的使用。国家食品安全风险监测计划每年均将雌二醇、己烷雌酚、己烯雌酚、己二烯雌酚等列为监测对象，尤其是婴儿配方奶粉中的雌二醇、己烷雌酚、己烯雌酚、己二烯雌酚更是监测的重点对象。

目前乳制品中雌二醇、己烷雌酚、己烯雌酚、己二烯雌酚等4种雌激素的测定方法主要有高效液相色谱法[2-3]和液相色谱-串联质谱法[4]。高效液相色谱法虽容易普及，但灵敏度低，且需要较为苛刻的条件才可使4种物质完全分离，达到准确定量的要求；液相色谱-串联质谱法因具有极高的选择性和灵敏度，可不要求高分离度亦可准确定量，但该设备较为昂贵，普及率不及高效液相色谱法，且往往需要固相萃取及同位素内标，测定成本极高。

柱切换-液相色谱法[5]是近几年兴起的应用于复杂基质的测定方法，其主要特点是在线净化、浓缩，在获得较为理想的净化效果和灵敏度的同时，简化了样品的前处理步骤，达到降低测定成本及减少人为误差的目的。文献[6]应用二维液相色谱法建立了配方奶粉中维生素B12的测定方法，该方法相比于传统的免疫亲和柱固相萃取-液相色谱法，测定周期缩短了40 min，测定成本降低了85%。本工作针对配方奶粉中的雌二醇、己烷雌酚、己烯雌酚、己二烯雌酚等4种雌激素建立了柱切换-液相色谱法，在获得极高灵敏度的同时，大大降低了测定成本，可适用于一般实验室的日常风险监测。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Dionex UltiMate 3000 型高效液相色谱仪，配六通阀、大体积自动进样器、紫外检测器；Beckman Coulter Allegra 64R 型高速离心机；Millipore Integral 3 型 超 纯 水 装 置；N-EVAP 112 型 氮 气 吹干仪。

4种雌激素标准储备溶液:100.0 mg·L－1，分别称取10.0 mg的雌二醇标准品、己烷雌酚标准品、己烯雌酚标准品、己二烯雌酚标准品，用适量的甲醇溶解并定容至100.0 m L。

4种雌激素混合标准溶液系列:分别移取适量的4种雌激素标准储备溶液，用甲醇稀释配制成1.0，2.5，5.0，10，20 μg·L－1的 混 合 标 准 溶 液系列。

雌二醇标准品、己烷雌酚标准品、己烯雌酚标准品、己二烯雌酚标准品的纯度依次为99.0%，98.5%，99.0%，99.5%。

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲酸均为色谱纯，试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

Thermo BioBasic SEC-120净化柱(300 mm×7.8 mm，5μm)，Waters XBridge BEH C18分析柱(150 mm×4.6 mm，2.5μm)；样品室温度15 ℃，柱温45 ℃；流量0.8 m L·min－1；进样量1.0 m L；测定波长280 nm。流动相:A 为水，B 为甲醇。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution program

柱切换模式见图1。

图1中阀位置为1～2时，试验进行系统平衡、分析，即开启净化模式；当阀位置切换为1～6时，试验进行目标物洗脱及收集，即开启分析模式。切换时间为0 min 时，阀位置为1～2；切换时间为15.0 min时，阀位置为1～6；切换时间为16.5 min时，阀位置为1～2。

1.3 试验方法

称取婴儿配方奶粉样品约5.0 g于50 m L带盖离心管中，加入10 m L 水超声溶解后，加入20 m L乙腈，混匀后超声提取30 min，以15 000 r·min－1转速在5 ℃下离心10 min，转移上清液于另一离心管中。残渣用10 m L乙酸乙酯提取，合并两次提取液，充分振荡后静置，待分层。转移上层有机相，弃去下层水相，有机相于40 ℃下用氮气吹至近干，加入2 m L的50%(体积分数)甲醇溶液溶解，溶解液过0.22μm 滤膜，按仪器工作条件进行测定。

图1 柱切换模式Fig.1 Column switching mode

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

4种雌激素混合标准溶液的色谱图见图2。

图2 4种雌激素混合标准溶液的色谱图Fig.2 Chromatogram of mixed standard solution of 4 estrogens

2.2 分析柱的选择

文献[3]用Nova-Pak C18色谱柱(150 mm×3.9 mm，4μm)使原本较难分离的己烷雌酚、己烯雌酚和己二烯雌酚得到了较好的分离，但其使用的流动相p H 为3.5，色谱柱柱温为55 ℃，为色谱柱耐受的极限条件，不利于色谱柱的使用寿命。文献[7]使用Xterra C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5μm)获得了4种雌激素的分离，所使用的流动相为磷酸盐缓冲溶液，该流动相稳定时间较长，且极易造成色谱柱及管路系统的腐蚀、堵塞，实用性受限。考虑到此类问题后，试验尝试仅用水和甲醇作为流动相，对3种不同规格的分析柱进行比较，结果见图3。

图3 使用不同分析柱时4种雌激素的色谱图Fig.3 Chromatograms of 4 estrogens with different analytical columns

由图3 可知:Dionex Acclaim120 C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5μm)的分离度较差，无法将4种目标化合物进行分离；Waters XBridge C8色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)较 之Dionex Acclaim120 C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5μm)有显著提高，但己烷雌酚和己烯雌酚未能达到完全分离，影响准确定量；Waters XBridge BEH C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，2.5μm)的分离度最佳，4种目标化合物均得到完全分离，完全满足准确定量的要求。原因主要为Waters XBridge BEH C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，2.5μm)的填料颗粒直径为2.5μm，相比于其他色谱柱的5μm 填料具有更好的柱效，且填料使用了核壳技术，在相同的流量下具有更低的柱压。试验选择Waters XBridge BEH C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，2.5μm)作为分析柱(即第二根色谱柱)。

2.3 净化柱的选择

净化柱(即第一根色谱柱)是用于样品的净化与富集，并与第二根色谱柱配合使用，也就要求其既具有高通量又要能与第二根色谱柱兼容。试验采用两根流动相体系可与反相C18兼容的净化柱进行试验，结果见图4。

由图4可知:虽然两者对目标物均有较好的保留，但 Thermo BioBasic SEC-120 色 谱 柱(300 mm×7.8 mm，5μm)的效果较好，不仅将目标物与部分杂质分离，且峰形较为对称，峰宽较窄，有利于后续操作；Agilent ZORBAX GF-250 色谱柱(250 mm×9.4 mm，4μm)的净化效果不明显，杂质与目标物基本共流出。因此，试验选择Thermo BioBasic SEC-120 色 谱 柱(300 mm×7.8 mm，5μm)为净化柱，目标峰的截取时间为15.0～16.5 min。

2.4 提取溶剂的选择

雌二醇、己烷雌酚、己烯雌酚和己二烯雌酚是强亲脂性物质，在甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有机溶剂中的溶解度较高。试验针对的是配方奶粉基质，富含蛋白质和脂肪，因此首选的提取溶剂为乙腈，其具有极佳的蛋白沉淀效果[8-9]。试验分别比较了乙腈提取1次、乙腈提取2次以及先乙腈提取，再乙酸乙酯提取对4种雌激素提取效率的影响，结果见图5。

由图5 可知:仅用乙腈提取1 次，提取效率仅50%左右，进行2次提取后，提取效率明显提高；先乙腈提取，再乙酸乙酯提取的效果要优于两次均用乙腈提取的效果。两次乙腈提取的提取效率略低的原因可能是乙腈提取后需用盐析使有机相与水相分离，有极少目标物被包裹或吸附在固体盐中。乙酸乙酯与水不互溶，将两次提取液合并静置数分钟后，无需盐析水相与有机相即可分离，因此可获得较好的提取效率。试验选择先乙腈提取，再乙酸乙酯提取。

图4 使用不同净化柱时4种雌激素的色谱图Fig.4 Chromatograms of 4 estrogens with different purification columns

图5 提取溶剂对4种雌激素提取效率的影响Fig.5 Effect of extraction solvent on extraction efficiency of 4 estrogens

2.5 标准曲线和检出限

按仪器工作条件对1.0，2.5，5.0，10，20μg·L－1的4种雌激素混合标准溶液系列进行测定，并绘制标准曲线。结果表明:4种雌激素的质量浓度均在1.0～20μg·L－1内与其对应的峰面积呈线性关系，线性回归方程和相关系数见表2。

以3倍信噪比计算方法的检出限(3S/N)，以10倍信噪比计算方法的测定下限(10S/N)，结果见表2。

表2 线性回归方程、相关系数、检出限和测定下限Tab.2 Linear regression equations，correlation coefficients，detection limits and lower limits of determination

2.6 精密度和回收试验

按试验方法对空白配方奶粉样品进行加标回收试验，每天平行测定6次，重复测定11 d，计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD)，结果见表3。

由表3 可 知:回收率为90.0% ～105%，日内RSD为1.6%～5.4%，日 间RSD 为3.5%～6.2%。

表3 精密度和回收试验结果Tab.3 Results of tests for precision and recovery

2.7 方法比较

使用本方法及国家标准方法GB/T 22992－2008对同一加标的空白配方奶粉样品(加标量0.5μg·kg－1)进行分析，结果见表4。

表4 本方法与国家标准方法的比较(n＝5)Tab.4 Comparison between the method and the GB method(n＝5)

由表4 可知:本方法相比于GB/T 22992－2008，时间可节省30%，费用节省80%。本方法准确度、精密度与液相色谱-串联质谱法相当[10-11]。

本工作先用乙腈沉淀配方奶粉中的蛋白，再用乙酸乙酯提取、浓缩提取液，然后采用凝胶柱净化、浓缩，反相C18分析柱分离，紫外检测器测定，方法的灵敏度与稳定性得到了大大的提高，而样品的测定周期及测定成本却显著降低，非常适用于配方奶粉中雌二醇、己烷雌酚、己烯雌酚和己二烯雌酚等4种雌激素的测定。