高效液相色谱法结合一测多评法对隔山消发酵前后3种苯乙酮类化合物含量变化的分析

杨 玲，向家俊，李齐激，杨 艳，廖 秀，杨小生，杨 娟∗

(1.贵州大学 药学院，贵阳550025； 2.贵州医科大学 省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室，贵阳550014；3.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵阳550014)

隔山消系萝藦科植物牛皮消或白首乌的块根，其味甘、苦，性微温，广布于四川、贵州、云南等地。隔山消具有消食化积、养阴补虚、抗衰老、补血提气、补血生乳、消水退肿等功效，临床上用于治疗虚损劳伤、腹痛腹胀、急慢性胁痛、腹水、腰腿疼痛以及血虚乳少等症状[1-2]。隔山消的化学成分主要有苯乙酮类、甾体苷类、香豆素类、木脂素类、有机酸类等，其中所含C21甾体皂苷和苯乙酮类是其抗肿瘤与抗免疫的主要活性成分[3-4]。虽然该药材未列入食品使用序列，但民间有悠久的食用历史，《本草纲目》、《天宝本草》、《陕西中草药》、《贵阳民间药材》等著作均有记载其食疗方剂[5]。

我国早在一千多年前就已将微生物发酵的方法应用于中药炮制当中，是最早利用微生物转化天然药物的国家[6]。作为药品和食品的传统加工方法，微生物发酵一直被我国人民沿用至今，通过发酵使其功能性成分得到进一步优化，或增效，或减毒[7-9]。在对隔山消发酵液中功效成分的前期研究中，发现苯乙酮类成分的含量对隔山消免疫活性具有一定的影响[10]，为更好地评价隔山消发酵前后苯乙酮类成分的含量，本工作采用高效液相色谱法结合一测多评法(QAMS)建立同时测定隔山消和隔山消发酵液中2，4-二羟基苯乙酮、2，5-二羟基苯乙酮和白首乌二苯酮等3种苯乙酮类化合物的方法，以2，4-二羟基苯乙酮为参照物，计算2，5-二羟基苯乙酮和白首乌二苯酮的相对校正因子，进而计算其含量，并与外标法测得结果进行比较，为进一步建立隔山消发酵液质量评价方法提供参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260型高效液相色谱仪，包括四元泵、在线脱气机、自动控温自动进样、柱温箱、二极管阵列检测器(DAD)、色谱工作站；KQ-3000 型数控超声波清洁器；BIC-400型人工气候箱。

3种苯乙酮类化合物的混合标准储备溶液:含0.48 g·L－12，4-二羟基苯乙酮、0.24 g·L－12，5-二羟基苯乙酮、0.32 g·L－1白首乌二苯酮，称取适量的2，4-二羟基苯乙酮、2，5-二羟基苯乙酮、白首乌二苯酮对照品，置于10 m L 容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度。

乙腈、甲醇均为色谱纯，试验用水为超纯水。

1.2 色谱条件

Thermo C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，柱温30 ℃；流量1.0 m L·min－1；进样量10μL；测定波长265 nm。流动相:A 为水，B为乙腈，C 为甲醇。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Program of gradient elution

1.3 试验方法

1.3.1 隔山消发酵液的制备

隔山消药材于2017年9月采自贵州清镇，经鉴定为萝藦科植物牛皮消的块根。

称取100.0 g隔山消样品，加入6倍质量的水，粉碎制成匀浆，再添加10.0 g蔗糖、0.5 g高效酒曲，密封称重，25 ℃发酵14 d，称重，加水补足减失质量，经0.45μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，得隔山消发酵液。

1.3.2 隔山消样品溶液的制备

称取100.0 g隔山消样品，加入6倍质量的水，粉碎制成匀浆，再添加10.0 g蔗糖，密封称重，25 ℃浸泡14 d，称重，加水补足减失质量，经0.45μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，得隔山消样品溶液。

1.3.3 空白溶液的制备

称取1.0 g蔗糖、0.5 g高效酒曲置于锥形瓶中，再加入6 m L水，密封称重，25℃浸泡14 d，称重，加水补足减失质量，经0.45μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，得空白溶液。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按色谱条件对隔山消发酵液、隔山消样品溶液、3种苯乙酮类化合物的混合标准溶液和空白溶液进行测定，其色谱图见图1。

由图1可知:2，4-二羟基苯乙酮、2，5-二羟基苯乙酮和白首乌二苯酮的分离度较好。

2.2 测定波长的选择

按色谱条件采用DAD 对3种苯乙酮类化合物的混合标准溶液进行测定，在波长190～400 nm 内对2，4-二羟基苯乙酮、2，5-二羟基苯乙酮和白首乌二苯酮进行紫外全波长扫描。结果表明:2，4-二羟基苯乙酮、2，5-二羟基苯乙酮和白首乌二苯酮的最大吸收波长均为265 nm 左右。试验选择测定波长为265 nm。

2.3 标准曲线和检出限

分别移取3种苯乙酮类化合物的混合标准储备溶 液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 m L 置 于6个2 m L容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，作为3种苯乙酮类化合物的混合标准溶液系列。按色谱条件对上述混合标准溶液系列进行测定，以3种苯乙酮类化合物的质量浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，进行线性回归，绘制标准曲线。3种苯乙酮类化合物的线性范围、线性回归方程和相关系数见表2。

以3倍信噪比计算方法的检出限(3S/N)[11-12]，结果见表2。

2.4 精密度试验

按色谱条件对3种苯乙酮类化合物的混合标准溶液(含0.24 g·L－12，4-二羟基苯乙酮、0.12 g·L－12，5-二羟基苯乙酮、0.16 g·L－1白首乌二苯酮)连续测定6次，计算2，4-二羟基苯乙酮、2，5-二羟基苯乙酮和白首乌二苯酮峰面积的相对标准偏差(RSD)依次为1.5%，1.5%，1.1%。

按试验方法制得同一批的12份隔山消样品的样品溶液和发酵液，并按色谱条件进行测定。结果表明:样品溶液中2，4-二羟基苯乙酮、2，5-二羟基苯乙酮和白首乌二苯酮测定值的RSD 依次为0.30%，0.34%，0.42%；发酵液中2，4-二羟基苯乙酮、2，5-二羟基苯乙酮和白首乌二苯酮测定值的RSD依次为0.24%，0.80%，0.38%。

图1 隔山消发酵液、隔山消样品溶液、3种苯乙酮类化合物的混合标准溶液和空白溶液的色谱图Fig.1 Chromatograms of fermentation broth of Cynanchum bungei Decne，solution of Cynanchum bungei Decne sample，mixed standard solution of 3 acetophenone compounds and blank solution

表2 线性范围、线性回归方程、相关系数和检出限Tab.2 Linearity ranges，linear regression equations，correlation coefficients and detection limits

2.5 回收试验

选取已知含量的12份隔山消粉末样品，按试验方法制得样品溶液和发酵液，并按色谱条件进行加标回收试验。

回收试验结果见表3。

表3 回收试验结果(n＝6)Tab.3 Results of test for recovery(n＝6)

2.6 相对校正因子和相对保留时间的测定

分别移取3 种苯乙酮类化合物的混合标准溶液，以不同进样体积注入色谱仪，按色谱条件测定色谱峰面积和保留时间，以2，4-二羟基苯乙酮为参照物，计算2，5-二羟基苯乙酮和白首乌二苯酮的相对校正因子和相对保留时间，结果见表4。

表4 相对校正因子和相对保留时间Tab.4 Relative correction factors and relative retention time

由表4可知:不同进样体积时，2，5-二羟基苯乙酮和白首乌二苯酮相对于2，4-二羟基苯乙酮的相对校正因子和相对保留时间基本相同。

试验考察了在一测多评法的建立过程中，2，4-二羟基苯乙酮对2，5-二羟基苯乙酮和白首乌二苯酮的相对校正因子和相对保留时间的重现性。结果表明:各相对校正因子和相对保留时间的重现性均较好。

2.7 外标法与一测多评法的比较

选取同一批隔山消样品12份，按试验方法制得样品溶液和发酵液，并按色谱条件分别采用外标法和一测多评法计算3种苯乙酮类化合物的含量，一测多评法以2，4-二羟基苯乙酮为参照物，一测多评法结果和外标法结果的Pearson相关系数，见表5。

表5 外标法结果和一测多评法结果的比较(n＝6)Tab.5 Comparison of the results of external standard method and QAMS(n＝6)

由表5可知:一测多评法结果和外标法结果相似性极高。一测多评法在隔山消样品溶液和隔山消发酵液中3种苯乙酮类化合物质量评价中的应用是可行的。

2.8 隔山消发酵前后3种苯乙酮类化合物的含量变化

选取同一批隔山消样品12份，按试验方法制得样品溶液(6份)和发酵液(6份)，采用一测多评法计算3种苯乙酮类化合物的含量，结果见表6。

由表6可知:隔山消发酵液中2，4-二羟基苯乙酮和2，5-二羟基苯乙酮含量高于原药材中2，4-二羟基苯乙酮和2，5-二羟基苯乙酮含量，隔山消发酵液中白首乌二苯酮含量低于原药材中白首乌二苯酮含量。

表6 隔山消样品发酵前后3种苯乙酮类化合物的含量(n＝6)Tab.6 Content of 3 acetophenone compounds before and after fermentation of Cynanchum bungei Decne sample(n＝6) mg·g－1

与原药材相比，发酵液中2，4-二羟基苯乙酮、2，5-二羟基苯乙酮含量较高，白首乌二苯酮含量较低。用甲醇对发酵药渣进行提取，计算发酵药渣中的3种苯乙酮类化合物的含量，与发酵液中3种苯乙酮类化合物的含量进行累计。与原药材相比，发酵药渣和发酵液中白首乌二苯酮的总量基本一致，2，4-二羟基苯乙酮总量和2，5-二羟基苯乙酮总量均略有升高。文献[13-15]报道丹皮酚通过微生物转化为2，4-二羟基苯乙酮，该成分也存在于隔山消中。试验利用高效酒曲对丹皮酚进行发酵，结果表明，高效酒曲能成功转化丹皮酚得到2，4-二羟基苯乙酮。未见通过微生物转化得到2，5-二羟基苯乙酮的报道。