鲁米诺-铁氰化钾流动注射化学发光法测定红葡萄酒中白藜芦醇的含量

刘玉萍，姚悦悦，蒋泳汝，王修中∗

(1.青岛农业大学 附属医院，青岛266109； 2.青岛农业大学 化学与药学院，青岛266109)

白藜芦醇，又称为芪三酚，是一种多酚类化合物，其化学名称为(E)-3，5，4-三羟基二苯乙烯，主要来源于花生、葡萄(红葡萄酒)、虎杖、桑椹等植物，是一种天然的抗氧化剂，可以预防和治疗肿瘤、动脉粥样硬化、心脑血管疾病，也可降低血液黏稠度抑制血小板凝结和预防癌症等[1]。目前，测定白藜芦醇的方法主要有高效液相色谱法[2]、气相色谱法[3]和毛细管电泳法[4]。尽管这些方法具有高的灵敏度，但是所用仪器昂贵，且需要专业技术人员操作。因此，需发展简单、快速、灵敏的白藜芦醇测定方法。

由丹麦学者RUZICKA 首次提出的流动注射(FIA)方法的运用，促进了分析过程的自动化，目前已经广泛渗透到分析化学领域[5]。FIA 可以用较简单的试验设备在广泛的领域中实现自动化和高效率，还能够通过单次测定提供有关样品的不同稀释程度，或样品与试剂不同混合比例的多维信息[6-7]。与其他光学测定方法相比，化学发光法无需复杂的光路和分光元件，具有灵敏度高和重现性好的优点，普通的实验室可以根据自己的试验需求，进行组装，操作简单方便[8-11]。目前报道的化学发光体系中，鲁米诺是使用最普遍且量子产率较高的化学发光试剂之一。在碱性条件下，它可以被多种氧化剂氧化，由基态激发至激发态，发出波长425 nm 的光[12]，但其自身被氧化的反应速率较慢或发光强度较弱，如果有催化剂或增敏剂存在，其发光强度将大大增强。一些药物可以作为催化剂或增敏剂，从而实现对药物的直接或间接测定[13-14]。流动注射与化学发光法相结合，具有操作简单、灵敏度高、线性范围宽、容易自动化等特点。

白藜芦醇能够显著增强鲁米诺-铁氰化钾化学发光反应的强度。因此，本工作结合流动注射，考察了碱性介质中白藜芦醇对鲁米诺-铁氰化钾化学发光体系的催化性能，据此建立了简单、快速测定白藜芦醇的流动注射化学发光法，并将其用于红葡萄酒中白藜芦醇含量的测定。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

IFFM-E型流动注射化学发光分析仪；F-4600型荧光光谱仪；CF15RXII型落地离心机；PK-8D 型电热恒温水槽；PB-10型酸度计；G-2型恒温加热磁力搅拌器。

鲁米诺储备溶液:1×10－2mol·L－1，于4 ℃冰箱保存，放置一周，使用时用1×10－3mol·L－1氢氧化钠溶液逐级稀释。

白藜芦醇标准储备溶液:1.00×10－3mol·L－1，置于4 ℃冰箱保存，使用时适当稀释。

所用试剂均为分析纯，试验用水为二次去离子水。

1.2 仪器工作条件

仪器包含一个主泵、一个副泵、一个三通阀、一个混合器和一个多功能化学发光检测器，相连的计算机上有配套的参数控制软件，实现流动注射的进样和化学发光信号的采集。

将8×10－6mol·L－1鲁 米 诺 溶 液、2×10－5mol·L－1铁氰化钾溶液通过主泵引入系统；由副泵将白藜芦醇标准溶液引入系统。三路溶液经过三通阀和一定长度的管路快速混合均匀后进入流通池，产生发光信号经光电倍增管放大后，由计算机记录并显示信号强度。

仪器运行参数见表1。

表1 仪器运行参数Tab.1 Operating parameters of the instrument

1.3 试验方法

将购于当地超市的红葡萄酒样品经减压抽滤，除去其中的不溶性杂质颗粒，然后移取50 m L滤液于烧杯中，加热至沸腾，持续2 min(以除去红葡萄酒中挥发性芳香物质)，冷却至室温，以10 000 r·min－1转速离心5 min，取上清液，按仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 发光反应条件的选择

2.1.1 进样次序

试验考察了8×10－6mol·L－1鲁米诺溶液、2×10－5mol·L－1铁氰化钾溶液和白藜芦醇标准溶液的进样次序对反应体系发光强度的影响。结果表明:以8×10－6mol· L－1鲁 米 诺 溶 液、2×10－5mol·L－1铁氰化钾溶液作为载流，将白藜芦醇标准溶液注入载流后，可以获得基线稳定、重现性好的化学发光曲线。试验中将8×10－6mol·L－1鲁米诺溶液、2×10－5mol·L－1铁氰化钾溶液通过主泵引入系统，由副泵将白藜芦醇标准溶液引入系统。

2.1.2 碱性介质

动态电路总共会涉及滑动变阻器类型的串联电路、滑动变阻器类型的并联电路、开关类型的串联电路、开关类型的并联电路四个基本电路。本文采用从局部→整体→局部的分析方法，对四个基本电路进行完整、准确的分析，使学生能够全面掌握动态电路中所遇到的问题，提高学生分析问题、解决问题的能力。

鲁米诺-铁氰化钾体系在碱性介质中发生氧化还原反应所产生的发光强度最大。试验考察了1×10－1，1×10－2，1×10－3mol·L－1的氢氧化钠溶液和p H 10的0.01 mol·L－1碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液分别作为碱性介质时对反应体系发光强度的影响。结果表明:在1×10－3mol·L－1的氢氧化钠溶液中，试验获得的峰形较好且发光强度稳定。试验选择碱性介质为1×10－3mol·L－1的氢氧化钠溶液。

2.1.3 鲁米诺溶液的浓度

化学发光试剂对反应体系发光强度有很大的影响。试验考察了不同浓度的鲁米诺溶液对反应体系发光强度的影响。结果表明:随着鲁米诺溶液浓度的增加，反应体系的发光强度逐渐增大；当鲁米诺溶液的浓度大于8×10－6mol·L－1时，反应体系发光强度的增大程度逐渐减缓，基本趋于稳定。试验选择鲁米诺溶液的浓度为8×10－6mol·L－1。

2.1.4 铁氰化钾溶液的浓度

试验考察了不同浓度的铁氰化钾溶液对反应体系发光强度的影响，结果见图1。

由图1可知:随着铁氰化钾溶液浓度的增加，反应体系的发光强度先增大后减小；铁氰化钾溶液浓度为2×10－5mol·L－1时，反应体系的发光强度最大。试验选择铁氰化钾溶液的浓度为2×10－5mol·L－1。

2.2 干扰试验

按试验方法对4.00×10－7mol·L－1白藜芦醇标准溶液进行干扰测定，结果表明:当相对误差在±5%以内时，5 倍的柠檬酸、葡萄糖、抗坏血酸，20倍的Mg2＋、Ca2＋，50倍的淀粉、精糊、乳酸、乙醇，1 000倍的K＋、Na＋、NH4＋、Cl－、NO3－、SO42－均不干扰测定。

图1 铁氰化钾溶液的浓度对反应体系发光强度的影响Fig.1 Effect of concentration of potassium ferricyanide solution on chemiluminescence intensity of reaction system

2.3 标准曲线和检出限

图2 白藜芦醇标准溶液的浓度对鲁米诺-铁氰化钾化学发光体系发光强度的影响Fig.2 Effect of concentration of resveratrol standard solution on chemiluminescence intensity of the chemiluminescence system of luminol and potassium ferricyanide

试验结果表明:白藜芦醇的线性范围为1.00×10－8～1.00×10－6mol·L－1，线性回归方 程为ΔICL＝5.000×109c＋1.728×102(ΔICL为加入白藜芦醇后反应体系的发光强度与空白溶液发光强度的差值，c 为白藜芦醇的浓度)，相关系数为0.999 5。

根据3倍信噪比计算方法的检出限(3S/N)，结果为3.0×10－9mol·L－1。

2.4 精密度试验

按试验方法对4.00×10－7mol·L－1白藜芦醇标准溶液平行测定11 次，测定值的相对标准偏差(RSD)为2.6%。

2.5 样品分析

按试验方法对红葡萄酒样品进行分析，并对其进行3个浓度水平的加标回收试验，重复测定6次，样品分析结果见表2。

表2 样品分析结果(n＝6)Tab.2 Analytical results of the samples(n＝6)

由表2可知:回收率为95.9%～130%。

2.6 化学发光机理

鲁米诺的发光机理研究较多，普遍认为其氧化产物，即激发态的3-氨基邻苯二甲酸阴离子为发光体，其最大发射波长为425 nm[15-16]。为了研究鲁米诺-铁氰化钾体系的反应机理，试验采用荧光光谱仪(关闭激发光源)扫描其化学发光光谱，见图3。

由图3可知:鲁米诺-铁氰化钾体系和鲁米诺-铁氰化钾-白藜芦醇体系的最大发射波长均为425 nm，白藜芦醇的存在仅仅增加了发光强度，并没有产生新的发光体，因此白藜芦醇并没有改变化学发光机理。白藜芦醇结构中带有酚羟基，可以被强氧化剂氧化成激发态，在返回基态的过程中释放多余能量转移给基态的3-氨基邻苯二甲酸阴离子，从而产生更多激发态的中间体，返回基态时产生更强的化学发光信号。

另外，体系中的溶解氧在鲁米诺的氧化过程中也起到了一定的作用，试验对鲁米诺-铁氰化钾-白藜芦醇体系通氮气除氧15 min，发现发光强度降低了约30%。这个现象说明该体系的化学发光反应需要溶解氧的参与。基于以上讨论，推测其反应机理如下(hν 为光子能量):

白藜芦醇＋O2＋OH－→超氧自由基

超氧自由基＋鲁米诺＋铁氰化钾 →激发态的3-氨基邻苯二甲酸阴离子

激发态的3-氨基邻苯二甲酸阴离子 →基态3-氨基邻苯二甲酸阴离子＋hν

本工作基于白藜芦醇对鲁米诺-铁氰化钾化学发光体系具有明显的增敏作用，将流动注射和化学发光法结合为一体，采用鲁米诺-铁氰化钾流动注射化学发光法测定红葡萄酒中白藜芦醇的含量。