液相色谱-四极杆-静电轨道阱高分辨质谱法测定保健食品中11种磷酸二酯酶抑制剂

赵孔祥，杨 爽，柴铭骏，刘 旸，葛宝坤

(天津海关动植物与食品检测中心，天津300461)

磷酸二酯酶(PDE5)抑制剂，俗称那非类药物，以西地那非为代表，主要用于治疗男性勃起功能障碍。近年来，抗疲劳类保健品在市场上大量销售，多数消费者认为:保健食品药效缓和、毒副作用小、可以长期服用。但由于一些不法分子受利益驱使，为了增强其产品功效，在抗疲劳类保健品中大量非法添加壮阳类化学成分。消费者在不知情的情况下，长期或超剂量服用含有那非类药物的保健品，会出现头晕、恶心、青光眼等症状，甚至对心血管系统、神经系统、消化系统等造成严重损伤[1-2]。

保健食品中磷酸二酯酶抑制剂的测定方法主要有表面增强拉曼光谱法[3-4]、高效液相色谱法[5-6]、液相色谱-质谱法[7-11]以及高分辨质谱法等[12-15]。表面增强拉曼光谱法简便快速，但容易受到基质干扰且灵敏度不高。高效液相色谱法分离度高、专属性较强、分析速率快，但分析复杂样品时可能会有干扰，出现假阳性。液相色谱-质谱法兼具高效的分离能力和高专属性、高灵敏度的特性，可以同时得到目标化合物的保留时间、相对分子质量、离子碎片等信息，从而对其结构进行确证，提高了测定结果的可靠性，但受到方法的制约，只能对有限的目标化合物开展测定。高分辨质谱法通过精确质量数进一步提高了测定结果的可靠性，但灵敏度一般不如液相色谱-质谱法。四极杆-静电轨道阱高分辨质谱法的四极杆可根据质荷比对目标化合物离子进行筛选，由C型离子阱对待测离子进行富集，再运送至静电轨道阱高分辨质谱(Orbitrap)中获取精确质量数，同时运用高能诱导裂解(HCD)技术，由HCD 裂解池碎裂后获得丰富的碎片离子信息。根据精确质量数、同位素分布、二级质谱图相关性等在筛査的同时，实现高灵敏度的定性确证及定量。近年来四极杆-静电轨道阱高分辨质谱法在保健食品中非法添加成分测定方面的应用逐渐增加[16-19]，已有研究者将其应用于磷酸二酯酶抑制剂测定的报道[20]。

本工作采用液相色谱-四极杆-静电轨道阱高分辨质谱法(LC-Q-Orbitrap)，建立了同时测定保健食品中11种磷酸二酯酶抑制剂的方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Q-Exactive型静电轨道阱高分辨质谱仪，配Transcent 1250型液相色谱仪；Millipore MILLI-Q型纯水器；CR22GⅢ型高速离心机。

11 种磷酸二酯酶抑制剂标准储备溶液:0.100 g·L－1，分别移取适量的伐地那非、那红地那非、红地那非、羟基豪莫西地那非、西地那非、豪莫西地那非、氨基他达拉非、他达拉非、硫代艾地那非、伪伐地那非、那莫西地那非的标准品，用甲醇稀释而成。

11 种磷酸二酯酶抑制剂混合标准溶液:1.00 mg·L－1，分别移取适量的0.100 g·L－1的11种磷酸二酯酶抑制剂标准储备溶液，用50%(体积分数，下同)甲醇溶液稀释混合而成。

甲醇、甲酸、乙腈均为色谱纯；伐地那非标准品、那红地那非标准品、红地那非标准品、羟基豪莫西地那非标准品、西地那非标准品、豪莫西地那非标准品、氨基他达拉非标准品、他达拉非标准品、硫代艾地那非标准品、伪伐地那非标准品、那莫西地那非标准品的纯度依次为99.3%，98.3%，99.6%，99.9%，99.9%，99.6%，99.9%，99.5%，99.5%，99.7%，99.9%；试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1)色谱条件 Waters HSS T3 色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8μm)，柱温30 ℃；进样体积10μL；流量0.3 m L·min－1。流动相:A 为0.1%(体积分数，下同)甲酸溶液，B为乙腈。梯度洗脱程序:0～1.0 min时，B为2%；1.0～18.0 min时，B由2%升至100%，保持5.0 min；23.0～25.0 min时，B由100%降至2%。

2)质谱条件 电喷雾离子源，正离子模式(ESI＋)；毛细管电压3 500 V；离子传输管温度280 ℃，溶剂蒸发器温度300 ℃；全扫描分辨率70 000，自动触发二级质谱分辨率17 500；一级质谱驻留时间100 ms，二级质谱驻留时间50 ms；扫描质荷比(m/z)120～750；二级质谱采用自动触发方式产生碎片离子，碰撞裂解气为高纯氮气。其余质谱参数见表1。

1.3 试验方法

称取粉碎后的保健食品固体样品2.00 g 于50 m L的离心管中，加入50 m L的50%甲醇溶液。

移取保健食品液体样品10 m L，加入40 m L的50%甲醇溶液。

上述混合物涡旋混匀后，超声提取15 min，溶液用水定容至50.0 m L，离心后，取上清液，经0.22μm 微孔滤膜过滤后，按仪器工作条件进行测定。

如果保健食品样品中某成分检出量超过标准曲线的线性范围，需要进行适当稀释，重新分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

50μg·L－1的11种磷酸二酯酶抑制剂混合标准溶液的色谱图见图1。

2.2 提取溶剂的选择

样品的提取溶剂有水、甲醇、乙腈和乙醇等。根据11种磷酸二酯酶抑制剂的物理溶解性质，采用水和有机溶剂的混合溶液作为提取溶剂。试验考察了甲醇-水、乙腈-水、乙醇-水等3种提取溶剂对11种磷酸二酯酶抑制剂回收率的影响。结果表明:以甲醇-水作为提取溶剂时，11种磷酸二酯酶抑制剂的回收率相对较高。试验选择提取溶剂为50%甲醇溶液。

2.3 质谱条件的选择

1.00 mg·L－1的11种磷酸二酯酶抑制剂混合标准溶液通过流动注射直接注入质谱仪，电离方式优化表明11种磷酸二酯酶抑制剂在电喷雾正离子模式下灵敏度最高。采集11种磷酸二酯酶抑制剂母离子的精确质量数(见表1)。每种磷酸二酯酶抑制剂的理论精确质量数与实测精确质量数相对误差的绝对值都小于5×10－4%，静电轨道阱高分辨质谱可以提供高的可信度。优化碰撞能量，获得二级碎片信息，各种磷酸二酯酶抑制剂的多个子离子精确质量数见表1。子离子精确质量数的比对提高了测定结果的可靠性。进一步优化离子源雾化条件，获得最佳的灵敏度。试验选择的质谱条件见1.2节。

2.4 色谱条件的选择

超高压液相色谱(UPLC)柱由于粒径小，可以在低流量获得较高的柱效，因此试验采用100 mm的UPLC柱进行优化。磷酸二酯酶抑制剂的极性差别较大，试验对比了Waters HSS T3、Shield RP C18和BEH C18等3种色谱柱，由于Waters HSS T3色谱柱提升了极性化合物的保留，并且可以耐受高比例的水相和流动相，在低p H 下色谱柱寿命较长，且Waters HSS T3色谱柱的分离度优于其他两种色谱柱。因此，试验选用Waters HSS T3 色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8μm)。

图1 混合标准溶液的色谱图Fig.1 Chromatograms of mixed standard solution

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

流动相的组成对峰形、灵敏度及分离度有较大的影响。试验分别以乙腈和甲醇作为强洗脱溶剂，0.1%甲酸溶液、10 mmol·L－1乙酸铵溶液以及含0.02%甲酸的10 mmol·L－1乙酸铵溶液作为弱洗脱溶剂，互相组合进行试验。结果发现:在流动相中增加0.1%甲酸溶液能够改善大部分目标物的峰形，且能提高靶标物质的离子化效率，从而增强化合物的响应。试验中部分化合物保留时间较长，考虑到乙腈比甲醇洗脱能力强，采用乙腈作为流动相进行洗脱。通过优化梯度洗脱程序，大部分磷酸二酯酶抑制剂峰形对称，可实现基线分离。

表1(续)

综合考虑，试验选择0.1%甲酸溶液和乙腈作为流动相。

2.5 标准曲线和检出限

采用50%甲醇溶液对1.00 mg·L－1的11种磷酸二酯酶抑制剂混合标准溶液进行稀释，得到2，5，10，20，50，100μg·L－1的11种磷酸二酯酶抑制剂混合标准溶液系列。按仪器工作条件对上述混合标准溶液系列进行测定，并绘制标准曲线。结果表明:11种磷酸二酯酶抑制剂的质量浓度均在2～100μg·L－1内与其对应的峰面积呈线性关系，线性回归方程和相关系数见表2。根据10倍信噪比计算方法的测定下限(10S/N)，结果见表2。

表2 线性回归方程、相关系数和测定下限Tab.2 Linear regression equations，correlation coefficients and lower limits of determination

考虑样品稀释倍数，液体样品测定下限为0.1～2.5μg·kg－1，固体样品测定下限为0.5～12.5μg·kg－1。

2.6 精密度和回收试验

按试验方法对空白活力捷液样品(样品1)和空白锌补晶粉样品(样品2)进行加标回收试验，平行测定6次，计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD)，结果见表3。

由表3可知:回收率为75.7%～98.9%，RSD 为5.9%～14%。

2.7 样品分析

按试验方法对32个市售及电商平台的保健食品样品进行分析，其中1个电商平台的玛卡片样品中西地那非的质量分数为51.89 g·kg－1(提取液稀释10 000倍)，其色谱图和一级、二级高分辨质谱图见图2。

表3 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6) %

图2 样品色谱图和一级、二级高分辨质谱图Fig.2 Chromatogram of the sample and primary as well as secondary high resolution mass spectra

由图2可知:色谱保留时间、母离子精确质量数以及二级高分辨质谱图均与标准谱图一致，进一步确认了西地那非在样品中的存在。个别保健食品样品中确实存在磷酸二酯酶抑制剂非法添加问题。

本工作采用液相色谱-四极杆-静电轨道阱高分辨质谱法测定保健食品中11种磷酸二酯酶抑制剂的含量。高分辨质谱法提供的精确质量数信息提高了测定结果的可靠性。