香蕉叶缩合单宁超声提取工艺优化

赖晓琳， 张 刚，黄建军

(漳州卫生职业学院药学系,福建漳州 363000)

0 引言

单宁，又称为五倍子单宁酸，在自然界中广泛存在，属于天然可再生资源，其在医药化工领域有着广泛的应用前景.根据单宁的化学结构特征，可将其分为可水解单宁和缩合单宁.缩合单宁又称为原花色素，其是一类黄烷醇单体及其聚合体的多酚化合物，具有C6-C3-C6的结构特征[1].目前，缩合单宁的提取主要有水浴浸提[2]、微波辅助[3]、超声波辅助[4]等方法.超声波辅助提取能有效缩短提取时间，提高了提取率，因此受到了研究者的青睐.近年来，国内外对香蕉叶的研究主要是蛋白的提取，多糖的提取，纤维素的提取，而对香蕉叶缩合单宁的提取鲜有报道.

响应面优化法是一种实验条件寻优的方法，适宜于解决非线性数据处理的相关问题.它囊括了实验设计、建模、检验模型的合适性、寻求最佳组合条件等.通过对过程的回归拟合和响应曲面、等高线的绘制、可方便的求出相应于各因素水平的响应值.在各因素水平响应值的基础上，可以找出预测的响应最优值以及相应的实验条件.于正交试验相比其优势是：在实验条件寻优过程中，可以连续的对实验的各个水平进行分析，而正交试验只能对一个个孤立的试验点进行分析.

本研究以漳州市天宝镇的香蕉叶为原料提取缩合单宁，并利用响应面法优化其超声提取工艺，希望能为香蕉叶资源的进一步开发利用提供一定的实验基础.

1 材料与方法

1.1 材料试剂

香蕉叶：采于福建省漳州市天宝镇；儿茶素标准品：阿拉丁公司；无水甲醇(南京化学试剂股份有限公司)、无水乙醇(南京化学试剂股份有限公司)、浓盐酸(南京化学试剂股份有限公司)、香草醛(阿拉丁公司)均为分析纯；水为去离子水.

1.2 仪器与设备

FA1004电子分析天平(绍兴市景迈仪器设备有限公司)；KEJ-1000超声波清洗机功率480 W(张家港科净)；T6型紫外可见分光光度计(北京谱析通用仪器有限责任公司)；BJ-150中药粉碎机(德清拜杰)；101-1A立式电热恒温鼓风干燥箱(天津通利信达).

1.3 实验方法

1.3.1 香蕉叶粉的制备 取新鲜香蕉叶，用去离子水洗净，在50 ℃下烘干24 h，粉碎，过100目筛，干燥避光保存.

1.3.2 香蕉叶中缩合单宁的提取 准确称取1.0 g 的香蕉叶粉末，装入100 mL具塞锥形瓶中，按照实验设计的条件加入乙醇溶液后，在超声波清洗器中提取，提取完毕过滤，滤液作为香蕉叶缩合单宁提取物样液备用.

1.3.3 缩合单宁的测定 取0.5 mL香蕉叶缩合单宁提取物，加入3 mL 4 % 香草醛甲醇溶液和1.5 mL浓盐酸，充分摇匀后在30 ℃水浴中反应20 min[5]，在500 nm波长下用紫外分光光度计测定其吸光度，根据绘制的标准曲线求得缩合单宁质量浓度，继而进行香蕉叶缩合单宁的提取量的计算.

香蕉叶缩合单宁提取量(mg/g)=( V×ρ)/ (ω×1000)

(1)

式 中：V—提取液体积，mL；ρ—待测样液中缩合单宁的质量浓度，mg·mL-1；ω—香蕉叶粉末的质量，g.

图1 儿茶素标准曲线Fig.1 The Standard Curve of Catechin

1.3.4 儿茶素标准曲线的绘制 取0.5 mL儿茶素标准溶液，加入3 mL 4 %香草醛甲醇溶液和1.5 mL浓盐酸，充分摇匀后在30 ℃水浴中反应20 min[5]，在500 nm波长下用紫外分光光度计测定其吸光度，绘制标准曲线.

标准曲线方程为y= 2.600 02x+ 0.010 2，R2=0.999 7

1.3.5 单因素实验

(1)提取时间对香蕉叶缩合单宁提取量的影响

以80 %的乙醇为提取剂，液料比30 mL·g-1，超声波功率50 %，提取时间分别为10，20，25，30，40 min.测定香蕉叶缩合单宁的提取量.

(2)乙醇浓度对香蕉叶缩合单宁提取量的影响

分别以70 %，75 %，80 %，85 %，90 %的乙醇为提取剂，在液料比30 mL·g-1，超声波功率为50 %的条件下，提取时间25 min.测定香蕉叶缩合单宁的提取量.

(3)液料比对香蕉叶缩合单宁提取量的影响

以85 %的乙醇为提取剂，分别在液料比20，25，30，35，40 mL·g-1，超声波功率50 %的条件下，提取时间25 min.测定香蕉叶缩合单宁的提取量.

(4)超声功率对香蕉叶缩合单宁提取量的影响

以80 %的乙醇为提取剂，液料比30 mL·g-1，超声功率分别为20 %，40 %，50 %，60 %，80 %的条件下，提取时间30 min.测定香蕉叶缩合单宁的提取量.

1.3.6 响应曲面设计方案 以单因素试验为基础，选取提取时间、乙醇浓度、液料比、超声功率4个因素，采用四因素三水平的响应面分析方法，因素与水平如表1所示.

表1 因素水平设计Tab.1 Design of Factor Level

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

图2 提取时间的影响Fig.2 The Effect of Extraction Time

2.1.1 提取时间对香蕉叶缩合单宁提取量的影响 如图2所示，以80% 的乙醇为提取剂，液料比30 mL·g-1，超声功率50%的条件下，随着提取时间的增加，香蕉叶缩合单宁的提取量在25 min内逐渐增大，在25 min时，达最大值为6.69 mg·g-1，当超声波处理时间继续延长时，缩合单宁提取量呈现逐渐下降趋势，其原因可能是因为当提取时间达到25 min时，缩合单宁几乎完全被提取出来，继续延长提取时间，会引起缩合单宁的降解和氧化[6]，因此选取25 min为最优的提取时间.

图3 乙醇浓度的影响Fig.3 The Effect of Ethanol Concentration

2.1.2 乙醇浓度对香蕉叶缩合单宁提取量的影响 如图3所示，在液料比30 mL·g-1，超声波功率为50 %的条件下，提取时间25 min的条件下，随着乙醇浓度的增大，缩合单宁的提取量先增大后减小，在85 % 时达到最大值，其原因可能是过高的乙醇浓度，使某些醇溶性、酯溶性杂质溶出量增加，与缩合单宁产生竞争性溶出，导致提取量的下降[7],故选择乙醇的浓度为85 %.

2.1.3 液料比对香蕉叶缩合单宁提取量的影响 如图4所示，以85 % 的乙醇为提取剂，超声波功率50 % 的条件下，超声波作用25 min的条件下，随着液料比的增大，缩合单宁的提取量逐渐增大，在液料比为25 mL·g-1时达到最大，在增大液料比，提取量反而有所下降.这是因为液料比增大可增加细胞内外质量浓度差，有利于缩合单宁的提取，但同时也会导致系统中单位体积提取液超声能量密度的降低，不利于缩合单宁的提取[8].因此，选择液料比为25 mL·g-1.

2.1.4 超声功率对香蕉叶缩合单宁提取量的影响 如图5所示，以80% 的乙醇为提取剂，液料比30 mL·g-1，提取时间30 min的条件下，随着超声功率的增大，缩合单宁的提取量逐渐升高，在超声波功率为50 % 时，缩合单宁的提取量达到最大值，之后再升高超声波的功率，提取率开始下降.可能是因为随着功率的增大，超声波的空化效应增强，加速了香蕉叶中缩合单宁的溶出，但功率过大，会使溶剂温度升高且较强的超声波空化效应会破坏缩合单宁分子的结构，使提取量降低.因此适合的超声波功率为50 %.

图4 液料比的影响Fig.4 The Effect of Liquid-solid Ratio图5 超声功率的影响Fig.5 The Effect of Ultrasonic Power

2.2 响应面分析结果

2.2.1 响应面实验设计方案及结果 以单因素实验为基础，根据Design-Expert 8.0.6的Box-Benhnken中心组合方法设计响应面实验方案，共得29个试验点，其中24个为析因点，5个为中心点.香蕉叶缩合单宁提取量为响应值，响应曲面实验设计方案及结果见表2.

表2 响应曲面分析实验设计及结果Tab.2 The Experimental Design and Results of Response Surface Analysis

表3 方差分析表Tab.3 The Analysis of Variance Table

2.2.2 回归方程拟合和方差分析 将表2中的实验数据进行多元回归拟合，建立回归模型，得到香蕉叶缩合单宁的提取量(Y)与提取时间(A)、乙醇浓度(B)、液料比(C)、超声功率(D)的二次多元回归方程为：

Y=7.07 + 0.013 A + 0.038 B + 0.59 C + 0.17 D + 0.035 AB + 0.085 AC - 0.010 AD - 0.20 BC + 0.14 BD - 0.015 CD - 0.36 A2- 0.45 B2- 0.48 C2- 0.59 D2

由回归方程可得出，各因素对香蕉叶缩合单宁提取量的影响大小顺序为液料比>超声功率>乙醇浓度>提取时间.

响应曲面各因素的方差结果见表3，由表3中的数据可得，该回归方程模型的P<0.01模型极显著，而失拟项不显著(P=0.088 3 >0.05)，差异不显著.模型的确定系数R2=0.994 5，调整系数RAdj2= 0.989 1，说明建立的模型能够解释98.91 % 响应值的变化，且有99.45 %来源于所选变量.除了一次项B，交互项AC影响显著和一次项A，交互项AB、AD、CD影响不显著之外，一次项C、D，交互项BC、BD，二次项A2、B2、C2、D2均影响极显著.

2.2.3 响应曲面分析 如图6-11图所示，香蕉叶缩合单宁提取量随提取时间、乙醇浓度、液料比、超声功率的增大而增大，达到各因素中心值后，香蕉叶缩合单宁提取量随各因素的增大而减小.液料比对香蕉叶缩合单宁的提取量影响最大，表现为曲面较为陡峭，因此控制好液料比对于提取效果十分重要.超声功率对于香蕉叶缩合单宁的提取量仅次于液料比，再次是乙醇浓度.提取时间变化幅度平缓，说明此因素对缩合单宁提取量影响较小.比较各图可知，乙醇浓度与液料比及乙醇浓度与超声功率的相互作用对缩合单宁的提取量影响较大，表现为响应面图较陡峭；而提取时间与乙醇浓度及提取时间和超声功率的相互作用对缩合单宁的提取量影响较小，表现为响应曲面较平缓.

图6 乙醇浓度与提取时间对缩合单宁提取量的影响Fig.6 Effect of Ethanol Concentration and Extraction Time on Extraction Capacity of Condensed Tannins图7 液料比与提取时间对缩合单宁提取量的影响Fig.7 Effect of liquid-solid Ratio and Extraction Time on Extraction Capacity of Condensed Tannins图8 超声功率与提取时间对缩合单宁提取量的影响Fig.8 Effect of Ultrasonic Power and Extraction Time on Extraction Capacity of Condensed Tannins图9 液料比与乙醇浓度对缩合单宁提取量的影响Fig.9 Effect of Liquid-solid Ratio and Ethanol Concen-tration on Extraction Capacity of Condensed Tannins图10 超声功率与乙醇浓度对缩合单宁提取量的影响Fig.10 Effect of Ultrasonic Power and Ethanol Concen-tration on Extraction Capacity of Condensed Tannins图11 超声功率与液料比对缩合单宁提取量的影响Fig.11 Effect of Ultrasonic Power and Liquid-solid Ratio on Extraction Capacity of Condensed Tannins

2.2.4 最优工艺的优化及验证 响应面提取香蕉叶缩合单宁的最优工艺条件为：提取时间25.44 min，乙醇浓度84.64 %，液料比28.13 mL·g-1，超声功率51.29 %，此条件下缩合单宁提取量预测值为7.27 mg·g-1.为符合实际操作，将最优提取条件微调为：提取时间25 min，乙醇浓度85 %，液料比28 mL·g-1，超声功率50 %，进行平行验证实验，所测得缩合单宁提取量的平均值为7.15 mg·g-1，与预测值相对误差只有1.65 % ，说明利用响应面优化的方法有效，具有实际应用性.

3 结论

本文通过考察提取时间、乙醇浓度、液料比、超声功率对香蕉叶缩合单宁提取量的影响，利用响应面法分析获得提取香蕉叶缩合单宁的最佳条件为：提取时间25.44 min，乙醇浓度84.64 %，液料比28.13 mL·g-1,超声功率51.29 %，此条件下缩合单宁提取量预测值为7.27 mg·g-1；实际微调工艺条件为：提取时间25 min，乙醇浓度85 %，液料比28 mL·g-1,超声功率50 %，实际提取率为7.15 mg·g-1，与理论值相对误差为1.65 %，验证了最优提取工艺的有效性，为香蕉叶缩合单宁资源利用与研究提供参考.