胃癌患者Hp感染与CyclinD1、NF-kb、Beclin1表达及临床病理特征的关系分析

张海云，蔡晓波，郭宝明，李建周

(1.西宁市第二人民医院 消化内科，青海 西宁810003；2.上海市第一人民医院 消化内科,上海200080)

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，临床表现为恶心、吞咽困难、厌食、腹泻、反酸等，具有较高的致死率。目前对胃癌的治疗以手术联合化疗为主，但由于胃癌细胞增殖能力较强，因而肿瘤生长迅速，且能迅速发生局部或远处转移，因而胃癌预后较差，其5年生存率不足40%[1]。幽门螺旋杆菌(Hp)是一种革兰阴性菌，可在内黏膜上皮内繁殖。有研究表明，Hp感染与胃癌密切相关[2]。细胞周期蛋白D1(CyclinD1)是G1/S期细胞周期转换的正向调节因子，在细胞增殖过程中具有关键作用，而胃癌与细胞的增殖和凋亡密切相关[3]。核因子kb(NF-kb)是功能性蛋白质，其表达上调可增强基因转录活性，诱发肿瘤。自噬是细胞清除病原体的机制，在恶性肿瘤发生发展中会出现自噬异常。但Hp感染CyclinD1、NF-kb、自噬相关蛋白Beclin1、临床病理特征的关系如何，目前报道较少。基于此，本文以胃癌患者为研究，提高检测是否Hp感染，分析Hp感染与CyclinD1、NF-kb、Beclin1表达、临床病理特征的关系。现将研究作如下报道。

1 资料与方法

1.1 临床资料选取2015年1月-2018年12月在我院诊治的胃癌患者80例作为研究对象，其中男58例，女22例，年龄35-75岁，平均年龄(53.86±12.65)岁。纳入标准：①经胃镜和病理检查确诊为胃癌；②本研究经医院医学伦理委员会批准；③患者签署知情同意书。排除标准：①近3个月如出现大出血、严重胃穿孔者；②严重肝肾脾等脏器器质性病变者；③精神疾病等严重影响本研究者。

1.2 实验方法

1.2.1石蜡切片制备 采用10%的福尔马林固定活检标本，使用不同浓度的乙醇进行脱水，然后进行石蜡包埋，切成4 μm厚度的切片。

1.2.2Hp检测 采用改良Giemsa染色法和13C呼气试验对Hp进行检测，改良Giemsa染色法：将石蜡切片常规脱蜡复水后，采用2%的Giemsa染色剂进行30 min的染色，采用自然水洗后置入纯酒精内进行脱水，应用二甲苯进行透明，树胶进行封固，在油镜下观察Hp；13C呼气试验：让患者空腹6 g以上后再收集100 ml呼气，口服13C标记的尿素再收集100 ml呼气，连接13C标记的红外线能谱仪的检测孔进行检测，DOB>2.5则为阳性。结果判定标准：改良Giemsa染色法和13C呼气试验均为阳性则为阳性，否则为阴性。

1.2.3CyclinD1、NF-kb、Beclin1检测 采用免疫组化法检测CyclinD1、NF-kb、Beclin1的阳性率，将石蜡切片进行80 min的烤片(60℃)，常规脱蜡、水化组织切片后进行组织抗原修复(高温高压)，滴入3%的双氧水以阻断内源性过氧化物酶，然后加入20 μl的免疫人CyclinD1多克隆抗体、免疫人NF-kb多克隆抗体、免疫人Beclin1多克隆抗体，按照1∶200倍对抗体进行稀释，将切片放入湿盒内过夜(4℃)，第二天采用PSB冲洗3次，滴入生物素标记的一抗，进行30 min的孵育(37℃)，采用PSB冲洗，滴入生物素标记的二抗，进行30 min的孵育(37℃)，采用PSB冲洗，然后DAB显色，采用苏木素复染，盐酸酒精分化，并进行脱水封片。结果判定标准：随机选取5-10个高倍镜视野进行观察，以100个细胞数为1个视野进行计分，阳性细胞率5%、5%-24%、25%-49%、>50%的分别记0分、1分、2分、3分；以着色强度进行计分，呈淡黄色、黄色、棕黄色分别记1分、2分、3分；两种计分的乘积0分则为阴性、1-3分则为弱阳性、4-6分则为中阳性、7-9分则为强阳性，阳性率=(总例数-阴性)/总例数×100%。

2 结果

2.1 CyclinD1、NF-kb、Beclin1阳性率比较经Hp检测，Hp感染阳性55例(68.75%)。Hp感染患者CyclinD1、NF-kb、Beclin1阳性率分别为76.36%、63.64%、60.00%，与非Hp感染患者的48.00%、12.00%、36.00%比较明显较高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 胃癌患者Hp感染与CyclinD1、NF-kb、Beclin1阳性率比较

2.2 Hp感染与CyclinD1、NF-kb、Beclin1阳性率的相关性胃癌患者Hp感染与CyclinD1阳性率呈正相关(r=0.281，P=0.012<0.05)，与NF-kb阳性率呈正相关(r=0.479，P=<0.001)，与Beclin1阳性率呈正相关(r=0.223，P=0.047<0.05)。

2.3 Hp感染与临床病理特征的关系胃癌患者不同年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位、组织分化程度、组织分化类型的Hp感染率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。临床分期Ⅰ-Ⅱ期的Hp感染率为50.00%，与Ⅲ-Ⅳ期的84.09%比较明显较低，浸润程度T1+T2的Hp感染率为58.49%，与T3+T4的88.89%比较明显较低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。经二元Logistic回归分析，临床分期、浸润程度为胃癌患者Hp感染的独立影响因素(P<0.05)。见表3。

表2 不同临床病理特征胃癌患者Hp感染率比较[n(%)]

表3 胃癌患者Hp感染的多因素分析

3 讨论

我国胃癌的发生率和死亡率一直处于恶性肿瘤的前列，且男性多于女性。近年来胃癌的发生率有所下降，但由于胃癌早期无特异性的临床表现，因而诊断时患者已为中晚期，降低了患者的5年生存率[4]。多数研究认为，Hp感染与胃癌的发生发展有关，但致病机制尚未完全明了。数据资料显示，Hp感染率一般为40%-60%[5，6]。本文研究中，80例患者Hp感染55例，约为68.75%，稍高于数据资料，可能与样本数量及个体差异性有关。Hp感染后，可引起胃粘膜慢性、急形炎症反应，紊乱增生平衡与细胞凋亡，使胃癌相关基因变异，增加起端粒酶活性，胃黏膜上皮细胞线粒体基因发生变异，从而促进形成胃癌[7，8]。

CyclinD1定位于11p13，总长约15 kb，有外显子5个，内含子4个，是位于细胞核的G1期细胞增殖信号的一种蛋白。正常情况下，细胞进入S期CyclinD1就会迅速分解，当CyclinD1被激活且持续高表达时，将会缩短G1期，提前进入S期，导致细胞增殖失控，从而形成肿瘤[9,10]。本文研究中，Hp感染患者CyclinD1阳性率为76.36%，明显高于非Hp感染患者的48.00%；胃癌患者Hp感染与CyclinD1阳性率呈正相关。研究结果表明CyclinD1的高表达胃癌的发生发展密切相关，可能与CyclinD1高表达促进G1期到S期的转换有关。NF-kb调节功能多项，可参与调控多种基因的炎症、细胞增殖及凋亡、免疫应答，与肿瘤的生长、分化和转移密切相关。本文研究中，Hp感染患者NF-kb阳性率为63.64%，明显高于非Hp感染患者的12.00%；胃癌患者Hp感染与NF-kb阳性率呈正相关，与沈玲等[11]的研究结果相吻合。研究结果表明NF-kb的高表达胃癌的发生发展密切相关。在肿瘤发展早期，自噬可抑制细胞恶性转化，而在肿瘤发展晚期，自噬会为此肿瘤细胞的存活。Beclin1是自噬相关的蛋白，作为PI3K复合物形成的支架，而PI3K复合物形成自噬泡的第一步。本文研究中，Hp感染患者Beclin1阳性率为60.00%，明显高于非Hp感染患者的36.00%；胃癌患者Hp感染与Beclin1阳性率呈正相关，与胡云峰等[12]的研究结果相一致。研究结果表明Hp感染可能能诱导自噬细胞活性增强。

本文还分析了不同临床病理特征与Hp感染的关系，结果显示，临床分期Ⅰ-Ⅱ期的Hp感染率为50.00%，明显低于Ⅲ-Ⅳ期的84.09%，浸润程度T1+T2的Hp感染率为58.49%，明显低于T3+T4的88.89%；经二元Logistic回归分析，临床分期、浸润程度为胃癌患者Hp感染的独立影响因素。研究结果表明临床分期和浸润程度可独立影响Hp感染，因此对于临床分期和浸润程度高的胃癌患者，临床上应积极给予预防干预措施，以减少Hp感染。综上所述，胃癌患者Hp感染可能通过诱发CyclinD1、NF-kb、Beclin1异常参与胃癌的发生发展，Hp感染与临床分期和浸润程度有关。