降钙素原单克隆抗体的制备及鉴定应用

孙晶莹，孙丽君，封 青，李亚萍，李 研，季延红

(1.西安交通大学医学部基础医学院 病原生物学与免疫学系，陕西 西安710061；2.陕西省人民医院 中心实验室；陕西 西安710068)

降钙素原(procalcitonin)简称为PCT，是第11号染色体上(11p15,4)的单拷贝基因，是一种无激素活性的降钙素的前肽物质[1]，由116个氨基酸组成，是分子量大约13 kD的一种炎性介质[2-4]，人体在正常生理状态下，PCT由甲状腺滤泡旁细胞合成分泌，因此在甲状腺切除术和甲状腺肿瘤等患者中存在PCT异位分泌的情况，CURRIE J等研究者认为 PCT 有可能是一种内源性非类固醇类抗炎物质[5,6]，正常人群体内的血浆 PCT 水平小于 0.1 ng/ml[7]。研究表明当机体被细菌感染时，细菌内毒素会诱导刺激机体产生大量的PCT，感染早期PCT的水平即会升高，重症感染患者的PCT水平更高，而非细菌感染或过敏反应时PCT水平并不升高[8]。PCT的释放是炎性反应过程中的一个重要环节，相比于其它的生物学标志物，PCT在细菌感染的预测方面更有优势，对细菌感染的肺炎诊断灵敏度为82%，特异性为84%[9]。2001年，PCT作为一种诊断指标被国际脓毒症会议指定在脓毒症诊断中使用[10-12]，总之PCT在感染性炎症和指导抗菌药物合理使用中均有重要的意义[13]，目前PCT已经在临床检测以及指导抗菌药中广泛应用，临床上检测PCT的主要方法是双抗夹心免疫化学发光法，试剂盒的主要成分是能与PCT蛋白特异结合的PCT单克隆抗体，人血液中的PCT含量较低而且半衰期短，无法通过提取血液中的PCT获得，因此本研究利用基因工程的方法，从TT细胞中获得降钙素原的全长基因，表达出PCT蛋白，并制备了单克隆抗体，利用ELISA和western鉴定抗体的特异性和稳定性，并与临床检测试剂盒做了检测对比，为后期研究PCT提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、质粒与菌株

鼠骨髓瘤细胞株SP/20、人甲状腺髓伴癌细胞株(TT细胞)由陕西省人民医院中心实验室馈赠、感受态细胞BL21(DE3)、感受态细胞Transetta-T1、表达载体pEASY-E1购自北京全式金公司。

1.2 试验动物

SPF 级 4-6 周龄 BALB/c 小鼠，购自西安交通大学医学部动物中心。

1.3 主要实验试剂

DNA Marker、Taq酶、His镍柱均购于大连宝生物工程有限公司;质粒提取试剂盒购于北京天根生化科技有限公司;弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自sigma公司;HRP-羊抗鼠二抗，购自中杉金桥公司;小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(SEK003-100)购自Sino Biological公司;降钙素原检测试剂盒购自上海恒远生物科技有限公司。

1.4 pEASY-E1-PCT 质粒的构建

1.4.1PCT基因的获取

表1 引物序列表

NCBI查找PCT的序列，利用prime 5.0软件设计引物，序列如表1，培养TT细胞，提取RNA后反转录为CDNA，PCR扩增PCT的基因，扩增程序和体系如下：

PCR 反应体系 50 μl：cDNA模板4 μl，上下游引物各1 μl，dNTP 4 μl，primer star聚合酶0.5 μl，5×Buffer 10 μl，ddH2O 29.5 μl。

PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火 40 s，72℃延伸1 min，30 个循环；72 ℃延伸10 min。将获得PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收。

1.4.2载体的连接

回收的PCT基因加A，回收产物7.5 μl，Ex Taq 1 μl，10×Ex Taq buffer 1 μl，dATP 0.5 μl，混匀后72℃ 10 min。产物与pEASY-E1载体连接，连接产物用于转化Transetta-T1感受态细胞。取出感受态细胞，冰浴融化后，立即加入 5 μl 上述连接产物；混匀后冰浴25 min，42 ℃ 热 激30 s，加入700 μl LB液体培养基37℃振荡培养1 h，取150 μl涂布于含氨苄青霉素 的LB平板，37℃培养过夜，次日挑取平板的24个单菌落培养后进行菌液PCR鉴定。

PCR 反应体系20 μl：菌液模板5 μl，上下游引物各0.5 μl，rTaq mix 10 μl，ddH2O 4 μl。

PCR反应条件：94℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。

将获得PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，挑选出了3个阳性菌液，送测序后经比对正确后提取质粒，阳性质粒命名为pEASY-E1-PCT。

1.5 重组蛋白的诱导表达

将重组质粒pEASY-E1-PCT转化到Transetta(DE3) 感受态细胞中，Transetta(DE3)冰浴融化后，立即加入0.5 μl重组质粒；混匀后冰浴30 min，42℃热激45 s，然后快速将管子移入冰浴中2 min，加700 μl LB液体培养基37℃振荡培养1 h，取150 μl涂布于含氨苄青霉素 的LB平板，挑取克隆重组菌pEASY-E1-PCT/DE3接种于含氨苄青霉素的LB液体中，37℃震荡培养至OD600为0.5-0.6时，加入诱导剂IPTG(终浓度为0.33 mmol·L-1)进行诱导表达，诱导前收取1 ml菌作为对照，诱导6 h后收集菌体，利用SDS-PAGE进行鉴定，将表达蛋白命名为MBP-PCT，重组菌大量诱导表达后利用His镍柱纯化，纯化后透析浓缩用以制备单克隆抗体。

1.6 PCT单克隆抗体的制备

用重组蛋白免疫6-8周雌性BALB/C小鼠，抗原量为50 μg/只，用佐剂乳化，方法参考文献[14]，按常规方法制备单克隆抗体腹水。

1.7 PCT单克隆抗体的生物学特性分析

(1)单抗亚型鉴定：用小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒进行亚型测定；(2)单克隆抗体的纯化：辛酸-硫酸铵盐析沉淀法，先用正辛酸除去杂蛋白，再用饱和硫酸铵沉淀抗体，用PBS混匀后透析除盐，获得纯化后的抗体，经Nanodrop2000测定2株抗体的蛋白含量、ELISA 法测定抗体效价。(3)效价测定 ：ELISA法测定纯化后抗体效价；(4)抗体交叉鉴定：包被抗原解脲支原体、沙眼衣原体、肺炎支原体、肺炎衣原体、腺病毒、合胞病毒、2009年H1N1、原核表达EV71-VP1抗原及降钙素原，包被过夜，洗板后加入单克隆抗体上清原液，SP20培养上清为阴性对照，37℃孵育1 h；PBST洗板3次，加入1∶2500稀释的羊抗鼠酶标二抗，37℃孵育1 h；PBST洗板3次，以TMB 底物显色，2M硫酸终止显色，TMB在过氧化酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，用酶标仪测定 D450 nm值；(5)辣根过氧化物酶(HRP)标记PCT-5和PCT-8单抗，用ELISA检测酶标抗体的稀释度。

1.8 PCT单克隆抗体的应用

收集检验科中性粒细胞高的患者的血清及正常血清，双抗夹心检测血清标本，包被纯化的PCT-5抗体，二抗为PCT-5对应的HRP酶标抗体，检测样本血清中PCT含量，同时用购买的降钙素原试剂盒做检测，比较制备抗体的效果。

1.9 统计学分析

使用SPSS.21统计分析软件进行数据分析，以P<0.01为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 重组质粒pEASY-E1-PCT的构建

2.1.1PCR扩增得到了目的基因片段，片段大小435 bp，扩增结果如下图1，经载体构建后获得质粒，质粒的电泳结果如下图2。

图1 PCR扩增图 (1,2均为PCR产物)

图2 质粒电泳图

2.1.2质粒测序结果

将PCR鉴定阳性的质粒送北京华大基因进行测序，经与DNAMAN比对后测序结果正确，序列如下：

CATGGATCCATGGGCTTCCAAAAGTTCT

CCCCCTTCCTGGCTCTCAGCATCTTGGTCCTG

TTGCAGGCAGGCAGCCTCCATGCAGCACCAT

TCAGGTCTGCCCTGGAGAGCAGCCCAGCAGA

CCCGGCCACGCTCAGTGAGGACGAAGCGCGC

CTCCTGCTGGCTGCACTGGTGCAGGACTATG

TGCAGATGAAGGCCAGTGAGCTGGAGCAGG

AGCAAGAGAGAGAGGGCTCCAGCCTGGACA

GCCCCAGATCTAAGCGGTGCGGTAATCTGA

GTACTTGCATGCTGGGCACATACACGCAGG

ACTTCAACAAGTTTCACACGTTCCCCCAAAC

TGCAATTGGGGTTGGAGCACCTGGAAAGAA

AAGGGATATGTCCAGCGACTTGGAGAGAGA

CCATCGCCCTCATGTTAGCATGCCCCAGAAT

GCCAACTAA

2.2 重组蛋白的表达结果

15%的SDS-PAGE电泳显示，利用IPTG诱导后的目的蛋白大量表达，分子量约为16 kD，结果如图3所示。

图3 重组质粒诱导表达结果

2.3 PCT单克隆抗体的制备及鉴定

获得2株抗降钙素原的单克隆抗体，分别为PCT-5、PCT-8。经亚型测定试剂盒测定，PCT-5单抗的亚型为IgG2b，PCT-8单抗的亚型为IgG1，均为κ链,见表2。

2.4 PCT单克隆抗体的反应特性鉴定

通过包被抗原解脲支原体、沙眼衣原体、肺炎支原体、肺炎衣原体、腺病毒、合胞病毒、2009年H1N1、原核表达EV71-VP1抗原及降钙素原，鉴定单克隆抗体的反应性，结果如表3所示，结果表明，制备的PCT单克隆抗体特异性强，仅与降钙素原抗原反应，其余抗原结果均为阴性。

表2 单克隆抗体的鉴定

表3 PCT mAb反应性鉴定

2.5 HRP标记PCT-5单克隆抗体

利用间接ELISA方法检测HRP标记的PCT-5单克隆抗体的最佳稀释浓度，酶标PCT-5的最佳稀释度为104，如图4所示。

图4 ELISA检测HRP酶标抗体的最佳稀释浓度

2.6 PCT单克隆抗体的应用

选择PCT-5单抗株进行样本检测，双抗夹心ELISA法检测收集的临床样本，与商品化试剂盒进行结果对照，PCT-5单抗结果阳性率为74%，商品试剂盒阳性率为78%，二者方法检测一致率为96%，经SPSS21软件统计学分析，两种检测结果差异不具有统计学意义，P>0.05,见表4。

表4 PCT-5单抗与商品试剂盒检测样本比较结果(P>0.05)

3 讨论

PCT的释放是炎症反应过程的一个重要信号环节，PCT的含量指标与IL-6、IL-8、IL-10等相比，对严重细菌感染及脓毒症的早期确诊更灵敏和特异。大量的研究资料显示，细菌感染性疾病的发生发展和血液中PCT含量呈正相关，即随着感染的严重程度，体内的PCT由低到高，因此PCT是全身炎症反应的早期诊断指标，同时PCT在指导抗菌药物合理使用中也有重要意义[13]。因此PCT具有非常重要的临床诊断及研究价值。由于PCT在血液中存在的半衰期较短，从血液中来提取PCT蛋白很难实现，同时化学合成蛋白比较高，在实际工作中多考虑表达蛋白来研究。

本文选择培养TT细胞提取mRNA后进行反转录为cDNA后通过PCR扩增PCT的全长基因序列，避免了部分片段表达导致其蛋白信息的丢失，通过原核表达PCT蛋白并制备其单抗研究其意义，选择原核表达载体pEASY-E1，可以快速平端克隆PCR产物，其N端具有6×His蛋白纯化标签，后期方便纯化，克隆效率高，操作简单，表达量高，利用克隆的表达载体表达了目的重组蛋白，鉴定纯化后制备单克隆抗体，得到两株特异的单克隆抗体株，效价高达104和105，并将得到的单克隆抗体株包被板子检测临床样本血清中的PCT含量，与商品化的试剂盒进行检测结果比较，结果显示二者检测方法的一致率为96%，基本一致，但是对于血清中PCT含量较低的样本，我们制备的单抗相比于商品化灵敏度稍低一点，后期工作将对检测线及灵敏度进行优化研究，为后续的研究工作做好铺垫，本研究获得的重组PCT蛋白和单克隆抗体为后续研究及检测方法的研究提供了有效依据。