不明原因反复流产者T细胞中PD-1的表达及其临床意义

吴杰儒

(江西省妇幼保健院检验科，南昌 330006)

复发性流产(RSA)是指存在≥3次持续性自然流产现象，其病因与胚胎染色体异常、生殖道解剖异常、内分泌异常等因素有关，但有40%～50%的患者流产原因不明确，称为不明原因反复流产(URSA)[1]。有研究[2]发现，母体的妊娠免疫耐受失衡与URSA发生有关，而妊娠免疫耐受失衡常伴随着T细胞的异常增殖活化和细胞因子的异常分泌。程序性细胞死亡分子-1(PD-1)作为重要的抑制性共刺激分子，通过抑制T细胞的活化和增殖负性调控免疫应答。鉴于此，本研究探讨URSA患者T细胞中PD-1的表达及其临床意义，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018年5月至2019年5月江西省妇幼保健院收治的URSA患者20例(URSA组)，选择同期行人工流产的正常健康早孕妇女20例作为对照组。URSA组，年龄22～35岁，平均(28.67±3.16)岁；孕周5～12周，平均(8.75±2.13)周。对照组，年龄21～35岁，平均(28.39±3.02)岁；孕周4～12周，平均(8.28±2.35)周。2组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可对比性。知情同意书均由患者及其家属签署，且经本院医学伦理委员会批准。

1.2 入选标准

URSA患者既往无活产史，自身抗体阴性；对照组有活产史，无自然流产、死胎或死产史，孕期无腹痛及阴道出血，B超提示胚胎发育正常。排除标准：精神障碍者；严重器官功能异常者；有染色体异常、生殖道解剖异常、内分泌异常等。

1.3 检测方法

经患者知情同意后，采集研究对象的部分蜕膜组织和外周血，以磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡漂洗蜕膜，2 h内分离单个核细胞，重悬后备用。分离外周血和蜕膜组织中单个核细胞。单个核细胞中CD3+PD-1+T细胞的表达检测：取5 μL的CD3-FITC及PD-1-PE加入100 μL PBMCs悬液，设立同型对照，室温15 min避光孵育；加2 mL Buffer洗涤，10 min、300×g离心，弃上清液；加Buffer重悬细胞500 μL，流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司，型号：CyAN-ADP)检测CD3+PD-1+T细胞的表达情况，结果用百分比(%)表示。血浆中细胞因子含量检测：依据试剂盒操作步骤流程，用酶联免疫吸附法(ELISA)测外周血白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素10(IL-10)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平。

1.4 评价指标

记录外周血及脱膜组织CD3+PD-1+T细胞的表达;比较外周血IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α的水平。

1.5 统计学方法

数据由SPSS18.0软件处理，计量资料采用t检验，相关性采用一般线性双变量Pearson相关性检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血及蜕膜组织CD3+PD-1+T细胞的表达

与对照组相比，URSA组外周血及蜕膜组织CD3+PD-1+T细胞的表达更低(P<0.05)，见表1。

组别n外周血CD3+PD-1+T脱膜组织CD3+PD-1+T对照组2019.98±2.3731.09±4.05URSA组2014.27±1.3820.15±3.13t9.3119.558P<0.001<0.001

2.2 外周血IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α的水平

与对照组相比，URSA组IL-4、IL-10水平更低，IFN-γ、TNF-α水平更高(P<0.05)，见表2。

组别nIL-4ρ/(ng·L-1)IL-10ρ/(ng·L-1)IFN-γρ/(pg/mL)TNF-αρ/(ng·L-1)对照组2047.44±8.9216.65±5.0972.87±19.1322.61±9.06URSA组2024.65±9.087.38±2.11188.85±77.5945.52±15.69t8.0077.5246.4915.655P<0.001<0.001<0.001<0.001

2.3 URSA与PD-1和IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α水平的相关性

经Pearson相关性检验，URSA与外周血PD-1、蜕膜PD-1、IL-4、IL-10呈负相关(r<0，P<0.05)；URSA与IFN-γ、TNF-α呈正相关(r>0，P<0.05)。见表3。

表3 URSA与PD-1和IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α水平的相关性

3 讨论

在正常妊娠过程中，胚胎作为一种特殊的同种异体移植物，其在母体内存活并正常发育，母体的免疫系统需对胚胎产生免疫耐受，而特异性免疫抑制物及非特异性因子，可共同维持母体免疫系统对胚胎的免疫耐受，同时机体的多种免疫学因素通过有机协调参与妊娠免疫平衡，若胚胎免疫耐受降低，则可能导致流产[3-4]。

目前，URSA的免疫因素研究主要包含经典B7途径的CD28、CTLA-4等，和Treg细胞及其相关的Th细胞因子。PD-1属于细胞负性调节分子，可抑制T细胞活化，增殖负性调控免疫应答，并在调节免疫耐受、微生物感染及肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。本研究结果显示，与对照组相比，URSA组外周血及蜕膜组织CD3+PD-1+T细胞的表达更低，IL-4、IL-10水平更低，IFN-γ、TNF-α水平更高；经Pearson相关性检验，URSA与外周血PD-1、蜕膜PD-1、IL-4、IL-1呈负相关(r<0，P<0.05)，与IFN-γ、TNF-α呈正相关(r>0，P<0.05)，提示URSA患者外周血和蜕膜组织中CD3+PD-1+T细胞的表达降低，通过调节多种细胞因子，参与URSA发生。PD-1对维持免疫耐受及母胎免疫平衡，抑制免疫排斥具有重要意义，在正常妊娠中，PD-1可结合其配体PD-L1，负性调节T细胞受体信号，降低Th1细胞的增殖，阻碍IFN-γ、TNF-α等促炎因子的产生，同时激活Th2细胞，使IL-4、IL-10等抑炎因子处于高表达，进而维持免疫耐受[5]。IFN-γ对胚胎具有毒性作用，会抑制胚胎正常发育，导致流产现象[6]。但在胚胎正常发育过程中，TNF-α会与TNF受体大量结合，进而阻碍滋养细胞的生长、繁殖，干扰胚胎发育的营养供给，使胚胎着床难度增加[7]。IL-4、IL-10可维持正常妊娠，减少流产现象。因PD-1对单核细胞的抑制作用减弱，使URSA患者体内处于高水平的炎症状态，抑炎性细胞因子减少，促炎因子增多,从而参与URSA发病[8]。造成URSA的主要原因是由于免疫耐受遭到破坏,但其具体机制需进一步研究和探讨[9]。

总之，PD-1通过调节多种细胞因子而影响免疫平衡，参与URSA发病，可为治疗URSA潜在靶点提供理论依据。