亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定干旱胁迫前后玉米幼苗的总黄酮含量

任园宇，魏东伟，王中伟，周亚萍

（河南农业大学生命科学学院，郑州 450002）

0 引言

玉米是中国重要的粮食、饲料、工业原料和药物原料[1]。近年来，玉米种植地的干旱加剧，对玉米生产造成严重威胁。研究表明，玉米在生长发育过程中对水分的需求量大，苗期玉米对水分最敏感，此时遭受干旱胁迫，可造成玉米幼苗生长缓慢、成活率低，直接影响后期生长发育[2-3]。因此，研究干旱胁迫对玉米生理生化的影响，对保障玉米生产安全有重要意义。干旱、低温、高盐等逆境会造成植物细胞内自由基累积，使自由基的产生与清除平衡遭到破坏，积累的自由基会损伤膜的选择透性[4]，攻击细胞的脂质、DNA 和蛋白质，导致代谢异常[5]，最终影响植物正常生长发育。

黄酮类化合物是植物体内一类重要的具有抗氧化活性的次生代谢产物[6-7]，其基本骨架上的羟基取代基具有自由基清除活性，主要是通过电离出氢原子、中和氧自由基，并且与已经电离的黄酮类化合物结合成二聚体，防止逆向结合而清除自由基[8-9]。因此，黄酮类化合物能有效减缓干旱胁迫引起的自由基积累。现有研究表明，干旱胁迫能刺激植物体内次生代谢产物的产生与积累[10]。一定的干旱胁迫会引起植物叶片黄酮类化合物含量的变化[11-12]。因此，总黄酮含量可以作为评估玉米耐旱性的生理指标之一。

目前测定总黄酮含量的方法主要有紫外直接测定法、三氯化铝比色法和亚硝酸钠-硝酸铝比色法。其中，亚硝酸钠-硝酸铝比色法因精密度高、稳定性好、重现性好，被广泛应用[13]。本研究采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法来测定干旱胁迫前后玉米幼苗叶片总黄酮含量的变化，以期为研究干旱胁迫条件下玉米次生代谢产物总黄酮含量的变化和耐旱性品种的筛选提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

1.1.1 玉米籽粒 选取‘浚单20’、‘郑单958’、‘豫玉22’的玉米籽粒，其中‘浚单20’购自北京屯玉种业有限责任公司、‘郑单958’购自郑州秋乐种业有限公司、‘豫玉22’购自襄阳正大种业开发有限公司。

1.1.2 试剂 芦丁标准品（批号A0325409，北京伊诺凯科技有限公司），含量≥97%；无水乙醇（Ethanol，批号XK 13-011-00034），购自天津市富宇精细化工有限公司；亚 硝 酸 钠（NaNO2，批 号20080422）、硝 酸 铝（Al(NO3)3，批号20160919），均购自天津市华东试剂厂；氢氧化钠（NaOH，批号20121027），购自天津达森化工产品销售有限公司；聚乙二醇6000（PEG6000，批号Q/12HB 3891-2017），购自天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.1.3 仪器 UV-2600 紫外-可见分光光度计（日本SHIMADZU 公司）；DK-S22 电热恒温水浴锅（上海精宏试验室）；珠江牌光照培养箱（韶关市泰宏医疗器械有限公司）；HPX-9082不锈钢电热培养箱（上海博讯实业有限公司）；BS124S分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；MODEL800S 组织粉碎机（上海凌初环保仪器有限公司）。试验在河南农业大学生命科学学院植物解剖与生理研究室，于2019年3—5月进行。

1.2 样品的制取

1.2.1 玉米培育 玉米培育参考胡秀丽等[14]水培育苗方法。选取3 个玉米品种的饱满籽粒，用2%次氯酸钠(NaClO)进行浸泡消毒10 min，蒸馏水冲洗3～5次后保持33℃恒温水浴避光浸种8 h。将浸种后的籽粒转入28℃黑暗培养箱中催芽1～3天，选取萌发状态一致的籽粒移入水培周转箱，置于光照培养箱培养，温度控制在28℃/22℃（昼/夜），光合有效辐射(PAR)为400 μmol/(m2·s)，相对湿度(75±5)%，光周期14 h/10h（昼/夜）。

1.2.2 制备样品材料 待玉米幼苗的第3片叶完全展开后对植株进行分组处理，一组玉米幼苗正常培育作为对照组(CK)，另一组置于将营养液换为18%PEG6000的周转箱作为胁迫组(Drought)，处理时间为4 h。处理完成后，分别剪取2 组玉米幼苗第一片叶叶基以上部位为试验材料，于60℃恒温电热箱2 h烘干，经组织粉碎机粉碎过40 目分样筛，收集粉末于采样自封袋中，做好标记放置在干燥器中备用。

1.2.3 样品提取液的制备 根据黄酮类化合物易溶于乙醇与热水的提取特性，采用60%乙醇水浴加热的方法制备提取液[15]。准确称取1.2.2 中制备的玉米样品0.05 g 于10 mL 离心管，加入60%乙醇，将离心管做好标记于70℃恒温水浴中加热4 h，充分提取样品中的黄酮类化合物，离心后取上清液于10 mL容量瓶，用60%乙醇定容备用。

1.2.4 亚硝酸钠-硝酸铝比色法反应体系的设计 吸取1.2.3中制备的样品提取液2 mL于10 mL容量瓶，加入5%亚硝酸钠溶液0.5 mL，混匀后放置6 min，加入10%硝酸铝溶液0.5 mL，混匀后放置6 min，最后加入4%氢氧化钠溶液5 mL，并用60%乙醇溶液定容，混匀后放置15 min即得样品反应混合液。

1.3 总黄酮含量的测定

1.3.1 芦丁标准曲线的建立 称取适量芦丁标准品，使用60%乙醇溶解定容，制得芦丁标准溶液(0.2 mg/mL)。分别吸取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL的芦丁标准溶液(0.2 mg/mL)于10 mL容量瓶，按照1.2.4方法制得芦丁标准品反应混合液，利用紫外-可见分光光度计进行光谱扫描，选取峰值位置（本试验吸收峰位置为508 nm处）。以芦丁浓度(mg/mL)为横坐标，508 nm处的吸光值(a.u.)为纵坐标，绘制标准曲线，求出线性回归方程y=ax+b。

1.3.2 方法学考察

（1）线性考察。按照1.2.3 方法制备样品提取液，将其分别稀释为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL 的样品提取液，与亚硝酸钠-硝酸铝体系反应后测定紫外-可见吸收光谱图，确定各浓度样品反应混合液508 nm处吸光值，并以样品浓度(mg/mL)为横坐标，508 nm处的吸光值(a.u.)为纵坐标，绘制标准曲线，求出线性回归方程。

（2）精密度试验。准确称量相同样品6 份，按照1.2.3方法平行制备样品提取液，用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定总黄酮含量。

（3）稳定性试验。将已按照1.2.3方法制备的样品提取液放置于4℃冰箱，每隔0.5 h测定其总黄酮含量。

（4）加标回收率考察。称取6 份样品，分别加入0.5 mL浓度为0.02 mg/mL的芦丁标准品溶液，与亚硝酸钠-硝酸铝体系反应后测定508 nm 处吸光值，计算其总黄酮含量与加标回收率。回收率的计算见公式(1)。

式中，P表示加标回收率，C1表示样品测定值，C2表示加标样品测定值，C3为加标量。

1.3.3 单位样品的总黄酮含量测定 根据1.2.3 方法制备干旱胁迫前后3 个品种玉米幼苗叶片的提取液，按照1.2.4 方法制得各样品反应混合液，测定508 nm 处吸光值，根据1.3.1芦丁标准品溶液浓度与吸收峰值的线性回归方程，求各样品芦丁当量浓度，计算见公式(2)。

其中，C为单位样品总黄酮含量，A508为样品反应混合液508 nm处吸光值，a、b为1.3.1芦丁线性回归方程y=ax+b中相同常量。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线的建立

使用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定样品总黄酮含量，通常采用芦丁为标准品[16]。根据1.3.1所得光谱图（如图1所示），芦丁标准品反应混合液在508 nm处有明显的吸收峰，且随着芦丁标准品溶液浓度的升高，吸收峰值也随之升高。表明芦丁标准品溶液浓度在0.00～0.06 mg/mL范围内，与吸收峰值有良好的线性关系，标准曲线如图2 所示，其回归方程为y=12.296x+0.049，R2=0.999。

2.2 亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定玉米幼苗总黄酮含量的方法学考察

2.2.1 线性试验 线性试验紫外-可见光谱图如图3 所示，不同浓度样品提取液的亚硝酸钠-硝酸铝反应体系，在波长508 nm 处左右有最大吸收峰，与芦丁标准溶液在亚硝酸钠-硝酸铝反应体系下的吸收峰一致，且随着样品提取液浓度的升高，吸收峰值增大，确定了亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定玉米幼苗叶片总黄酮含量的可行性。标准曲线如图4 所示，回归方程为y=0.152+0.113x，R2=0.983，说明不同浓度样品提取液在1.00～6.00 mg/mL线性范围内与亚硝酸钠-硝酸铝反应体系下测得的总黄酮含量有良好的线性关系。

2.2.2 精密度试验 精密度结果如表1所示，6次平行试验总黄酮测定结果RSD值为3.48%。证明方法精密度良好，符合试验要求。

2.2.3 稳定性试验 黄酮类化合物稳定性易受温度、pH值和光照等的影响[17]，为了确定玉米幼苗叶片的黄酮类化合物提取液在实验室环境中的稳定性，对其进行稳定性考察。测量结果如表2，稳定性试验RSD=3.51%。表明样品提取液在放置3.5 h内测量其总黄酮含量，数据仍具有一定的稳定性。

2.2.4 加标回收率试验 加标回收率结果如表3显示：6次测定的平均回收率为102.29%，RSD=0.691%。说明此测定方法准确度较高，具有可行性。

2.3 3个玉米品种干旱胁迫前后的总黄酮含量的测定

对干旱胁迫前后的3个玉米品种样品采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法进行多次测定，根据1.3.3 中公式计算单位样品的总黄酮含量以及各个品种干旱胁迫前后总黄酮含量的变化值，如表4所示。

3 个玉米品种叶片的测定结果显示，干旱胁迫前总黄酮含量从高到低依次为：‘浚单20’＞‘郑单958’＞‘豫玉22’，干旱胁迫后总黄酮含量从高到低依次为：‘郑单958’＞‘浚单20’＞‘豫玉22’。3个品种玉米幼苗在干旱胁迫后叶片总黄酮含量均有所提升，其中‘郑单958’提升较高，为16.21%，‘浚单20’其次，为7.61%，‘豫玉22’提升最少，为2.67%，干旱胁迫后玉米幼苗叶片总黄酮含量增加值从高到低依次为：‘郑单958’＞‘浚单20’＞‘豫玉22’。

3 讨论与结论

本研究结果显示，一定的干旱胁迫促进玉米幼苗体内总黄酮含量的增加，这与陈贝贝等[12]银杏叶类黄酮含量随土壤含水量的减少而逐渐增加的研究结果以及孙爱清等[13]发现9个类黄酮代谢相关基因在干旱胁迫下显著上调表达的研究结果一致，说明植物体内黄酮类化合物的形成积累受干旱胁迫的影响。

表1 精密度试验结果

表2 稳定性试验结果

表3 加标回收率试验结果

表4 单位样品总黄酮含量(n=5)

不同品种玉米幼苗总黄酮含量在干旱胁迫后均呈上升趋势，但各品种的含量变化存在一定差异，‘郑单958’与‘浚单20’玉米幼苗叶片中的总黄酮含量在干旱胁迫后提升幅度较大，‘豫玉22’提升幅度较小。王向阳等[19]关于河南省夏玉米主栽品种抗旱特性研究结果表明，‘浚单20’和‘郑单958’均具有很强的抗旱性，赵霞等[20]关于16 种玉米的抗旱性评价研究结果也表明‘浚单20’和‘郑单958’均具有较强的抗旱性。上述研究说明，在一定的干旱胁迫条件下，玉米幼苗叶片总黄酮含量的变化与其耐旱性相关。

使用亚硝酸钠-硝酸铝比色法检测样品总黄酮含量时，由于紫外-可见分光光度计检测结果易受杂质影响，样品总黄酮含量的提取方法显得极为重要。白生文等[21]在沙棘果渣黄酮提取工艺结果中表示乙醇体积分数为60%时，提取率达到最大；段宙位等[22]表示乙醇体积分数达到60%时，有机溶剂与沉香叶黄酮类化合物间的极性差异才能达到最适水平，可使黄酮类化合物的溶出率达到最高。因此，本研究采用60%乙醇作为提取剂以提高黄酮类化合物的提取效率。周亚萍等[10]在检测干旱胁迫条件下玉米幼苗4种酚酸的含量变化时发现各酚酸含量变化不同，而不同的黄酮类化合物之间存在相互作用，表现出协同、拮抗、加成的抗氧化效应[23]。因此，若要进一步研究玉米幼苗黄酮类化合物与环境间的相关性，还需要用其他能够精准定性定量的方法如高效液相质谱串联等进一步研究玉米幼苗体内单一黄酮类物质对干旱胁迫的响应。

本研究采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法来测定不同品种玉米幼苗在PEG6000 模拟干旱胁迫前后的总黄酮含量变化。试验选取‘郑单958’、‘浚单20’与‘豫玉22’3个不同耐旱性的玉米品种作为研究对象，并对检测方法亚硝酸钠-硝酸铝比色法进行方法学考察，结果显示，精密度RSD值为3.48%、稳定性RSD值为3.51%、平均回收率达到了102.29%，均符合方法学要求。亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定结果显示，‘郑单958’、‘浚单20’和‘豫玉22’玉米幼苗在模拟干旱胁迫后叶片总黄酮含量分别提升了16.21%、7.61%、2.67%。表明耐旱性强的玉米品种‘郑单958’与‘浚单20’幼苗叶片的总黄酮含量较耐旱性差的‘豫玉22’提升幅度更大。上述研究结果证实，玉米幼苗叶片中总黄酮含量受干旱胁迫的影响，且在一定的干旱胁迫条件下，不同品种玉米幼苗叶片总黄酮含量的变化与其耐旱性相关。