江苏地区小麦赤霉病菌种群检测与抗药性分析

周华飞 ，吴佳文，杨红福，陈宏州，束兆林，饶 斌，朱建飞，姚克兵

（1江苏丘陵地区镇江农业科学研究所，江苏句容 212400；2江苏省植物保护植物检疫站，南京 210036）

0 引言

小麦作为最主要的粮食作物之一，在全球的种植面积达到2.2 亿～2.4 亿hm2，占谷物总产量的29%[1-2]。小麦赤霉病(wheat head blight)是威胁小麦粮食生产的主要病害之一，受气候变化和秸秆还田耕作制度影响，小麦赤霉病在北美和欧洲的危害不断加重[3-4]。小麦赤霉病是由镰孢菌(Fusarium)引起的一种真菌病害，在小麦扬花期和降雨等空气湿度大的气候条件下进行病原菌侵入，在中国主要危害江苏安徽等长江中下游麦区，平均年份减产13%左右，重灾年份减产可达50%，严重威胁国内小麦粮食生产[5]。在中国，镰孢菌主要存在：禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、亚细亚镰孢（Fusarium asiaticum，又名亚洲镰孢）、黄色镰孢(Fusarium culmorum)、燕麦镰孢(Fusarium avenaceum)、梨孢镰孢(Fusarium poae)和雪腐镰孢(Microdochium nivale)等15种[6-10]，其中禾谷镰孢和亚细亚镰孢占据绝对优势地位[11-12]。江苏省内禾谷镰孢主要分布于年平均气温低于15℃的淮北地区，而亚细亚镰孢主要分布于年平均气温高于15℃的淮南地区[13]。江苏地区小麦赤霉病主要的致病菌为亚细亚镰孢，其次为禾谷镰孢菌，其余的病原菌种类报道甚少[14]。

目前生产上对于小麦赤霉病的防治主要依靠种植抗病品种和使用化学药剂为主，在扬花期空气湿度大等发病较重年份，化学防治依旧是解决小麦赤霉病的主要手段[15-16]。随着田间发现多菌灵单剂抗药性的逐渐上升，其复配制剂逐步取代单剂成为一段时间内小麦赤霉病化学防治的主力药剂[17-20]。此外，三唑类杀菌剂戊唑醇和咪唑类杀菌剂咪鲜胺等低毒广谱高效的小麦赤霉病防治药剂也占据重要的市场份额，且逐步取代多菌灵等较老的杀菌剂[21-23]。本研究首先采用LAMP-PCR[24-27]技术检测江苏地区多种小麦赤霉病菌的优势种群，明确小麦赤霉病菌的遗传进化构成，检测了小麦赤霉病菌对多菌灵、戊唑醇和咪鲜胺的抗药性情况，以期为科学研究江苏地区小麦赤霉病的化学药剂防治提供技术指导。

1 材料与方法

1.1 供试药剂

多菌灵(5、10 μg/mL)、戊唑醇(5 μg/mL)和咪鲜胺(5 μg/mL)均为原药稀释配制，由江苏丘陵地区镇江农业科学研究所植保研究室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 试验条件及设计 本研究越冬稻桩取样地点为江苏省盐城市、溧阳市和通州市，共计15 份。本试验于江苏丘陵地区镇江农业科学研究所实验室进行室内子囊孢子的鉴定与抗药性检测。刮取每份样品稻桩上黑色子囊壳部分溶解于无菌水中，使用血球计数板检测子囊孢子浓度，并稀释合理倍数至每个PDA[28-29]培养皿(9 cm)中萌发出10～20个赤霉病菌单菌落，挑取赤霉病单菌落菌丝于另一个培养皿中培养至铺满整个培养皿为止。刮取PDA培养基表面上全部菌丝于2 mL离心管中，液氮条件下使用磨样机磨成粉状物，提取该菌落的全基因组DNA。全基因组DNA提取采用北京全式金生物技术公司产品EasyPure Plant Genomic DNA Kit 完成。LAMP-PCR 技术体系（上海生工生物工程有限公司等温扩增PCR 混合液（通用型））、检测目标病原菌、灵敏度与引物序列如表1 所示。本研究PCR体系(25 µL)如下：2×Lamp Master Mix，12.5 µL；FIP(10 µmol/L)，2 µL；BIP (10 µmol/L)，2 µL；L B(10 µmol/L)，1 µL；F3 (10 µmol/L)，0.5 µL；B3(10 µmol/L)，0.5 µL；DNA，25～100 ng；DNA Polymerase，0.5 µL；ddH2O，补足至25 µL。检测方法为琼脂糖电泳检测，显示不同大小条带组成的LAMP特征图谱。

本研究设置小麦赤霉病杀菌剂终浓度多菌灵是5 μg/mL 和10 μg/mL，戊唑醇是5 μg/mL，咪鲜胺是5 μg/mL。将上述3 个地区采集的稻桩黑色子囊壳刮取和碾碎混匀，加入2 mL 无菌水稀释，利用血球计数板在显微镜下检测子囊孢子浓度，加入无菌水稀释至合理倍数，使之在对照组每个PDA 培养皿(9 cm)中萌发出的小麦赤霉病原菌菌落数位于10～20 cfu，同时吸取等量混匀孢子液涂布于含有上述终浓度的杀菌剂PDA培养皿中，对照组和处理组萌发菌落清晰明显之后进行分别计数。每个终浓度杀菌剂PDA平板重复5次。

表1 LAMP-PCR技术体系、检测目标病原菌、灵敏度与引物序列

1.2.2 调查项目及方法 本研究子囊孢子的类群鉴定LAMP-PCR 电泳特征图谱为鉴定依据并计数。子囊孢子对3种杀菌剂的抗性频率计算见公式(1)。

2 结果与分析

2.1 小麦赤霉病菌优势种群鉴定

本研究将采自于江苏通州、盐城和溧阳地区的15个取样点共计75 份样品分别利用LAMP-PCR 技术鉴定了培养皿中单菌落的病原菌混合类群，鉴定了亚细亚镰孢和禾谷镰孢的电泳图像，如图1所示，图中1～15号阳性条带为亚细亚镰孢，16-17号阳性条带为禾谷镰孢，均由不同大小的片段组成混合条带，介于100～750 bp之间，不包含上述2种优势致病类群的单菌落18号则无扩增条带。上述75 份样品中亚细亚镰孢和禾谷镰孢检测结果如表2所示，亚细亚镰孢在75份样品中均有检出，占比达到100%；禾谷镰孢在江苏3 个地区的检出率平均值仅为11.3%；亚细亚镰孢为江苏3个地区小麦赤霉病菌的优势种群。

表2 江苏通州、盐城和溧阳地区赤霉病菌优势种群统计

2.2 小麦赤霉病菌子囊孢子抗药性频率检测

江苏3 个地区取样分离的子囊孢子对多菌灵(5、10 μg/mL)、戊唑醇(5 μg/mL)和咪鲜胺(5 μg/mL)杀菌剂的抗药性频率检测如表3 所示，江苏通州地区子囊孢子对多菌灵(5 μg/mL)抗性频率最高，达到54.5%，对多菌灵(10 μg/mL)抗性频率也显著高于其他2 个地区的抗性水平；江苏盐城和溧阳地区的小麦赤霉病菌对多菌灵抗药性频率稍低；江苏3 个地区均未检测到对戊唑醇(5 μg/mL)和咪鲜胺(5 μg/mL)具有抗药性的病原菌；江苏3 个地区对多菌灵均已产生较严重的抗药性，平均值达到38.5%，说明多菌灵单剂已不适合在上述江苏地区作为小麦赤霉病防治药剂使用。

3 讨论与结论

在影响国内小麦粮食生产的真菌病害范围内，小麦赤霉病已逐步成为危害最严重的病害，其分泌的呕吐毒素超标严重可直接导致人畜腹泻[32-33]。小麦赤霉病主要发生在长江中下游麦区，近些年来逐步北移至淮河以北的山东河南境内，对其防控的压力逐年增加[34-36]。小麦赤霉病的防控主要依靠化学杀菌剂，多菌灵等较老药剂单剂已无法有效控制其扩展，抗药性逐年增强，三唑类和咪唑类杀菌剂及其各自复配制剂正在成为主力药剂[16-21,37-40]。本研究以江苏溧阳、通州和盐城3 个地区采集的小麦赤霉病样品为试材，通过检测样品中包含的亚细亚镰孢和禾谷镰孢比例来确定小麦赤霉病菌在江苏地区的优势生理小种。检测结果中亚细亚镰孢的占比是100%，为优势小种，禾谷镰孢的占比仅有11.33%，与许苗等[27]的报道结果基本一致。本研究以上述地区样品分离的子囊孢子单菌落为试材，检测了对多菌灵、戊唑醇和咪鲜胺的抗性情况，结果显示对多菌灵抗药性频率介于26.3%～54.5%之间，属于严重抗药性，多菌灵单剂基本丧失对小麦赤霉病的控制效果，与宋益民等[16]报道结果基本一致。本研究未检测到对戊唑醇和咪鲜胺单剂产生抗药性的赤霉病菌株，未发现对上述2 种药剂产生抗药性，与高启迅[41]的报道结果一致，但周仁先已在自然界采集到对戊唑醇具有抗性的赤霉菌株，说明赤霉病菌对戊唑醇单剂已部分产生抗药性，本研究未检测到上述菌株可能原因是用药地域和时间上的差别，或是检测的菌株群体数量不足和药剂浓度过高导致的。

表3 江苏通州、盐城和溧阳地区赤霉病菌抗药性频率检测 %

传统上的小麦赤霉病菌组织分类学要求分离病原菌获取单孢，依靠形态学等手段进行鉴定，该方法耗时多、成本高和可靠性低。随着分子生物学的快速发展与应用，常规PCR逐渐应用于检测小麦赤霉病菌的种群组成，该方法较组织分类学更简单快速，准确度更高，但该方法严重依赖于引物的特异性，且检测周期仍旧偏长[42]。LAMP-PCR技术较组织分类学和常规PCR技术具有特异性和灵敏度最高、检测周期最短以及肉眼可观察等特点，成为小麦赤霉病菌快速检测的最佳方法，但该方法也存在明显不足，不能同时进行多重靶标位点的检测，需要严格无菌操作避免污染，定量分析能力不如qRT-PCR等，综合所有因素来说该方法是到目前为止小麦赤霉病菌快速鉴定的最佳方法[43-45]。本研究采用LAMP-PCR 技术完成了对江苏地区小麦赤霉病菌优势种群的鉴定，亚细亚镰孢成为优势生理小种，结果准确可靠，但本研究存在一定的不足，例如取样地区和试材数量仍旧偏少，要准确获取江苏地区小麦赤霉病的群体遗传和抗药性情况，还需要检测除亚细亚镰孢和禾谷镰孢之外的其他生理小种的数量。本研究采用的LAMP-PCR 技术依旧仅限于在实验室获取最终结果，无法在田间应用，未来需要开发可直接应用于田间快速鉴定小麦赤霉病菌的免疫ELISA 试剂盒。

综上，本研究明确了江苏通州、盐城和溧阳地区小麦赤霉病优势种群是亚细亚镰孢，禾谷镰孢占比较低；同时检测到上述地区小麦赤霉病菌对多菌灵单剂抗性严重，基本丧失防治效果；未检测到对戊唑醇与咪鲜胺单剂具有抗性的赤霉菌株，说明在一段时间内戊唑醇和咪鲜胺单剂及其复配制剂对小麦赤霉病仍具有较好防效。