接种外源微生物对堆肥中重金属铜锌铅形态变化的影响

郝丽娜 常瑞雪 李彦明 汪 杰 陈 清 赵恒宇

(中国农业大学 资源与环境学院/农田土壤污染防控与修复北京市重点实验室，北京 100193)

堆肥化处理是有机固体废物在多种微生物作用下将原料中不稳定有机类物质转化为稳定腐殖质类物质的过程，也是当前我国养殖粪污综合利用所采用的主要技术途径[1-2]，其中残留的重金属已成为限制畜禽粪便肥料化循环安全利用的主要因素[3]。残留重金属有机固体废弃物经堆肥后，由于有机物质大量降解而导致重金属相对浓缩[4-5]，但作物对堆肥产品中重金属的吸收比例显著降低[6-7]。为强化堆肥过程对重金属的钝化作用，利用外源物质降低堆肥重金属有效性是当前的研究热点,如生物炭和粉煤灰等[8-9]。

堆肥接种剂和功能微生物肥料是我国当前发展迅速的一个领域。在堆肥过程中添加微生物菌剂多集中在促进有机物快速降解、加快堆肥进程和抗病方面，其中涉及到微生物种类主要由木霉属、芽孢杆菌属和酵母属[10]。木霉属微生物通常被用作拮抗病原菌的功能菌，比如接种木霉可以有效延长牛粪堆肥的高温期和减少氮素损失，还可拮抗辣椒疫霉[11-12]。用于堆肥的芽孢杆菌属微生物多属于嗜热菌，是高温好氧堆肥中的优势菌，比如解淀粉芽孢杆菌可高效分解堆肥原料中的难降解的乙基纤维素，促进堆肥升温，其堆肥产品还可防控草莓土传病害[13-14]。酵母菌通常由于其发酵作用被添加在EM菌剂、VT菌剂等接种剂中，酵母菌群在堆肥中可以促进堆肥发酵，还可以合成生物活性物质，从而为其他的菌群提供养分[15]。在污水体系中，Siddiquee等[16]研究发现木霉对Cu和Pb具有很好的耐受性，并且具有很好的吸收能力，Allievi等[17]研究发现芽孢杆菌的表层蛋白可以对Zn产生吸附作用，Machado等[18]研究发现酿酒酵母活细胞和死细胞的形态及表面官能团没有明显变化，死细胞仍然对Cu有很好的吸附效果。但是目前在堆肥体系中微生物对重金属作用的研究鲜见报道，此方向具有很好的研究价值。本研究依据前人的研究，采用室内模拟堆肥试验的方法，探究接种外源微生物长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)对堆肥重金属铜锌铅形态的影响，旨在为优化堆肥工艺和畜禽粪便安全利用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

堆肥试验所用的猪粪取自北京市昌平区某规模化养猪场，玉米秸秆取自中国农业大学上庄试验站，经自然风干后粉碎至1 cm以下备用，供试猪粪与玉米秸秆的理化性状如表1所示；所用的微生物菌剂长枝木霉和解淀粉芽孢杆菌由山东金正大生态工程股份有限公司提供，酿酒酵母为市售食品级粉状菌剂(由安琪酵母股份有限公司生产)。

表1 供试猪粪与玉米秸秆的理化性质Table 1 Physical and chemical properties of swine manure and maize straw

1.2 试验操作与样品采集

按照混合物料初始含水率60%左右和碳氮比25左右的要求，将6 kg猪粪和2 kg玉米秸秆和2.4 L水混合均匀后平均分4份，设置不接种外源微生物的对照处理(CK)和按照湿重比5‰分别接种长枝木霉(T1)、解淀粉芽孢杆菌(T2)和酿酒酵母(T3)处理，同时采集混合物料的样品以备后续测定。将所有处理充分混合均匀等重加入8 L堆肥发酵罐，连接好堆肥反应器系统的传感器和管路，堆肥发酵罐底部和顶部分别置有进气口和出气口，均与硅胶管相连。进气口与气泵相连，对混合物料进行曝气，以保证整个过程处于好氧反应，每个发酵罐曝气量由转子流量计控制，调节曝气量为200 mL/min。进气口连接NaOH和硼酸溶液的吸收瓶，出气口分别连接2%硼酸溶液和1 moL/L NaOH吸收瓶。整个堆肥反应器系统的构成如图1所示。

之后分别在第3、7、12、19和26 d进行翻堆取样，样品采集采用多点采样法收集样品，然后用四分法取样，每次采集2份样品，一份立即进行冷冻处理(<-18 ℃)，用于测定pH、发芽指数(GI值)等指标；另一份经自然风干后，粉碎至100目备用，用于测定物料全碳、重金属总量和形态等指标。

图1 堆肥装置示意图
Fig.1 Schematic diagram of compost plant

1.3 分析方法

温度传感器为Pt-100，采集频率为每1 h记录1次数据；CO2累积量采用氢氧化钠吸收法，吸收液由0.1 moL/L的稀硫酸溶液滴定；物料有机质含量采用灼烧法测定[19]；GI值测定如下：称取10 g鲜样于250 mL塑料瓶中，按照固液比为1∶10，加 100 mL 去离子水，在恒温摇床上(25 ℃和200 r/min)震荡30 min，过滤得到浸提液，然后吸取5 mL于垫有定量滤纸的直径为9 cm的培养皿中，均匀的撒10个水萝卜种子，在避光和25 ℃的条件下培养 48 h 后测定，以加去离子水的培养为对照。GI(%)参照如下计算公式计算：

重金属总量采用王水提取法提取消解，重金属形态采用改进的BCR连续提取法[20]，主要包含可交换态、可还原态、可氧化态和残渣态。重金属含量使用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测定。重金属相关计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 不同处理对堆肥理化性质的影响

在堆肥过程中，微生物降解有机物会伴随热量产生，因此堆体温度的高低与微生物的新陈代谢作用密切相关[10]。由图2(a)可知，4个处理温度达到60 ℃以上的时间分别是第4、1、1和3天，即接种外源微生物有效缩短了堆体进入高温期的时间，且接种长枝木霉或解淀粉芽孢杆菌缩短了3 d，接种酿酒酵母可缩短1 d。《GB 7959—2012粪便无害化卫生标准》[21]中规定畜禽粪便堆肥温度在50～55 ℃以上持续5～7 d即可达到无害化，本试验4个堆肥处理 55 ℃ 以上高温期分别为12、13、13和18 d，均已达到无害化标准，且在堆肥中接种微生物延长了高温期。在微生物降解堆肥有机质的过程中会利用环境中的O2，释放CO2和水。由图2(b)可知，堆肥第2～13天为CO2释放的高峰期，这也与堆肥温度变化趋势大致相同。由图2(c)可知，各堆肥处理的有机质含量均随堆肥时间推移逐渐减少，CK、T1、T2和T3处理的有机质含量较各自初始值分别减少了11.16%、15.38%、18.23%和15.15%，即T2中添加解淀粉芽孢杆菌后更利于有机质的降解。由图2(d)可知，接种微生物的处理GI值均在堆肥 12 d 率先超过80%，CK处理在第26天超过80%，表明接种长枝木霉和解淀粉芽孢杆菌比对照提前14 d实现堆肥腐熟。在堆肥26 d结束时，各处理的GI值为92.11%～107.63%，排序为T3>T2≈T1≈CK，表明堆肥腐熟度极高。

2.2 铜(Cu)的形态变化

由图3(a)可知，各处理的可还原态Cu分配率由堆肥前的38.19%分别降至11.86%、10.00%、4.98%和11.04%；相对应的Cu可氧化态分配率由堆肥前的30.79%增为65.39%、59.05%、75.73%和60.17%，这表明堆肥后Cu向更稳定的形态发生转变。将Cu可交换态和可还原态分配率加和为有效态来看，由图3(b)可知，有效态相对钝化率为T2(80.96%)>T1(67.46%)>T3(64.08%)>CK (63.61%)，这表明与对照相比，接种微生物可以使得Cu的有效性进一步降低，且解淀粉芽孢杆菌钝化效果>长枝木霉>酿酒酵母。

2.3 锌(Zn)的形态变化

由图4(a)可知，Zn在堆肥前后均以可交换态和可还原态为主，二者之和占比达75.87%～81.51%，而可氧化态和残渣态占比较低，表明堆肥中Zn的有效性较高。经过堆肥后各处理Zn可交换态分配率变化较为明显，从堆肥前的25.30%分别降至11.27%、10.81%、9.26%和9.54%，从Zn的可交换态相对钝化率来看，T2(63.38%)>T3(62.28%)>T1(57.27%)>CK(55.45%)。由图4(b)可知，将Zn可交换态和可还原态分配率之和作为有效态来比较相对钝化率，T2(5.02%)>T3(0.10%)>T1(-0.30%)>CK(-2.05%)，这表明较对照而言，在堆肥中接种解淀粉芽孢杆菌和酿酒酵母可以进一步降低Zn的有效性。

图2 温度(a)、CO2累积排放量(b)、有机质含量(c)、GI(d)变化
Fig.2 Changes of composting temperature (a), cumulative CO2emissions (b), Organic matter (c) and GI (d)

图3 堆肥前后Cu各形态变化(a)及相对钝化率(b)
Fig.3 Cu morphology changes before and after compost (a), relative passivation rate of Cu after compost(b)

2.4 铅(Pb)的形态变化

由图5(a)可知，与对照相比，接种长枝木霉后可氧化态分配率提高了30.49%，接种解淀粉芽孢杆菌堆肥后可还原态Pb分配率降低了40.89%，接种酿酒酵母后Pb残渣态分配率提高了56.00%。由图5(b)可知将Pb可交换态和可还原态分配率之和作为有效态来比较Pb的相对钝化率，可以得出：T2(41.00%)>T3(11.51%)>T1(5.01%)>CK(2.54%)，这表明与对照相比，接种微生物可以进一步降低Pb的有效性，并且接种解淀粉芽孢杆菌的效果最佳。

3 讨 论

重金属的可交换态、可还原态、可氧化态和残渣态这四种形态的有效性依次降低，因此本研究主要通过对比堆肥前后可交换态和可还原态分配率变化来判断重金属钝化效果[22]。由图2温度、CO2累积排放量、有机质含量和GI值数据可知，在猪粪和玉米秸秆的堆肥中分别接种长枝木霉、解淀粉芽孢杆菌、酿酒酵母后加速了堆体升温、促进了有机质的降解并且加快了堆肥腐熟，这是因为接种外源微生物后提高了堆肥体系中微生物的活性，优化了微生物的种群结构[23]，且综合作用效果解淀粉芽孢杆菌>长枝木霉>酿酒酵母，这也与重金属铜锌的钝化效果一致，加入解淀粉芽孢杆菌的处理对铜锌铅的形态变化均表现出明显效果，加入长枝木霉和酿酒酵母对铜锌铅的作用效果虽不及解淀粉芽孢杆菌，但也优于对照组。因此，堆肥体系中微生物的活性高低可能会与重金属的钝化有很大关联。

图4 堆肥前后Zn各形态变化(a)及相对钝化率(b)
Fig.4 Zn morphology changes before and after compost (a) and relative passivation rate of Zn after compost (b)

图5 堆肥前后Pb各形态变化(a)及相对钝化率(b)
Fig.5 Pb morphology changes before and after compost (a) and relative passivation rate of Pb after compost (b)

这是由于微生物细胞壁表面的脂多糖、肽聚糖、膜蛋白、脂磷壁酸和磷壁酸等结构使得其具有了羧基、羟基、氨基、磷基和硫基等官能团[24-25]。微生物细胞表面的羧基和羟基等活性官能团上的N、O和S等原子利用孤对电子与Cu2+、Zn2+和Pb2+发生配位发生络合和鳌合反应[26-28]，另外细胞壁表面的硫基和磷酸基可以和重金属离子结合形成沉淀[29]，并且这种微生物产生的化学作用不会随着微生物的凋亡而结束，细胞凋亡后微生物细胞壁表面的官能团也不会被破坏。Carrie等[30]指出木霉可以利用氨基、硫基、羰基与Cu和Pb发生络合、鳌合反应，Allievi等[17]研究发现芽孢杆菌表层蛋白对Zn2+有很好的吸附作用，Machado等[18]指出酿酒酵母对Cu有很好的络合作用。这均与本研究结果一致，长枝木霉对Cu和Pb有较好的钝化作用，解淀粉芽孢杆菌对Zn表现出很好的钝化作用，酿酒酵母对Cu的钝化效果较好。另外，微生物生命活动过程中会分泌胞外聚合物，这些物质也是大分子的蛋白质多糖化合物，可以和重金属离子发生络合、鳌合反应[31]。也有研究指出生防芽孢杆菌可以分泌铁鳌合酶，而这种铁鳌合酶也可以结合Zn2+[32]，这也可能是本研究中解淀粉芽孢杆菌对Zn有较好钝化效果的原因。

但是由于微生物的生命活动和细胞的降解，微生物对重金属产生的作用仅是相对的钝化，并非绝对钝化，待有机肥施用到土壤中，经历漫长岁月后重金属是否依然被固定，这值得进一步研究。

4 结 论

1)在猪粪和玉米秸秆堆肥体系中在接种外源微生物对堆肥理化性质有了明显改善。首先接种外源微生物可提前3、3、1 d使堆肥温度上升至60 ℃并延长高温期；其次接种微生物后堆肥体系中有机质的降解量明显加大；另外接种长枝木霉和解淀粉芽孢杆菌还明显缩短了腐熟过程。

2)添加外源微生物后明显降低了重金属Cu、Zn和Pb的有效性。3种微生物中，解淀粉芽孢杆菌对Cu、Zn和Pb的有效性降低效果都较好。相对钝化率分别为80.96%、5.02%和41.00%；长枝木霉对Cu和Pd的有效性降低效果较好，相对钝化率分别为67.09%和5.01%；酿酒酵母对Cu和Pb的有效性降低效果较好，相对钝化率分别为64.46%和11.51%。因此可以针对不同需求选择微生物。