有机肥施用量和树龄差异对苹果园土壤真菌群落的影响

2020-05-30 10:56柴小粉杨雅菲韩振海许雪峰张新忠
中国农业大学学报 2020年5期
关键词:树龄苹果园施用量

柴小粉 杨雅菲 张 杰 韩振海 许雪峰 张新忠 吴 婷 王 忆*

(1.中国农业大学 园艺学院,北京 100193; 2.农业农村部园艺作物营养与生理重点实验室,北京 100193; 3.北京农学院 植物科学技术学院,北京 102206)

苹果作为世界四大水果之一,是全球食用最广泛的水果,我国是世界苹果第一生产大国。2017年我国苹果种植面积222万hm2,产量4 139万t,分别占世界苹果种植面积和产量的45%和49.78%[1]。与欧美国家种植苹果的方式有所不同,我国果园管理常以大量化肥的投入作为保持树体生长和稳产增收的保障[1],而长时间较低的肥料利用效率造成资源浪费、土壤理化性质改变、生物环境恶化、树势衰弱及产量降低等一系列问题[2-3]。2015年,国家提出“到2020年化肥使用量零增长行动方案”,提出“精、调、改、替”4条技术路径,其中“替”指有机肥代替化肥的施用。随着有机肥料投入比例逐渐增加,通过改善土壤状况,一定程度上缓解土壤养分不均衡现象,并促进植物生长[4-5]。

近年来,随着微生物的研究发展,土壤微生物也引起了广泛的关注,尤其是土壤微生物与土壤元素相互作用越来越受到人们重视[6-8]。土壤微生物分布受自然因素(地理位置、气候条件及土壤类型等)[9-10]和人为因素(施肥和种植等)[11]的共同影响。土壤真菌是评价土壤质量的关键指标之一,其活动影响着生态系统中的物质循环和能量流动,以及无机质的分解与有机质的矿化及腐殖化,并在改良土壤肥力和维持生态系统平衡等方面发挥作用[12-13]。此外,土壤中存在可以引发植物病害的真菌[14],同时也有一些真菌可以作为有益菌促进植物生长发育或抑制病虫害发生[15-16]。苹果树作为多年生植物,长时间生长在固定条件下,其对元素的选择性吸收极易造成土壤养分亏缺;同时,根系分泌的小分子物质可以作为微生物生长和繁殖的碳源[17],使得微生物类群富集,影响植物生长[18]。有研究表明,适量有机肥的施用增加了土壤真菌群落的多样性[12],而关于有机肥肥施用量和树龄对土壤真菌变化的研究相对较少。

北京市处在暖温带半湿润大陆性季风气候,属于苹果适宜栽培的区域,且作为都市型果树产业发展的领头羊,有机肥施用覆盖范围比较广泛。本研究对北京地区各果园内苹果真菌菌群组成差异进行对比,探讨真菌与有机肥、树体三者间的关系,以期为通过调节真菌群落组成,减少化肥施用,最终实现改善土壤环境、增强树体生长及果实品质的目标提供基础数据和技术支撑。

1 材料方法

1.1 供试材料

试验果园位于北京市昌平区(40°15′36″N, 116°13′19″E),属于暖温带,半湿润大陆性季风气候,年均气温13 ℃,年均降水量535 mm,降水主要集中在夏季,全年日照2 390 h。该地区土壤以褐土为主。果园主栽品种为富士,嫁接用基砧为八棱海棠,中间砧为SH系列。本研究包括4个处理:5年树龄的果园,每棵树每年分别施用有机肥35(5M35)和50 kg(5M50);15年树龄的果园,每棵树每年分别施用有机肥50(15M50)和100 kg(15M100),有机肥为牛粪,施肥方式为条施。

1.2 土壤样品采集

本试验于2019年8月进行取样,具体取样方式如下:在果树树冠投影内缘,避开施肥点,去除表面凋落物,采用“S”采样方法取0~20 cm的土壤5份混合成一个样品,每个处理3次重复。土壤样品过2 mm筛后分为2份,一份放入干冰之后转移至 -80 ℃ 冰箱,用于微生物的群落分析;另一份自然风干,用于测定土壤理化性质。

1.3 土壤理化性质测定

土壤理化性质测定参照鲍士旦[19]的方法。采用电位法(ISO 10390∶2005)测土壤pH(土水体积比1.0∶2.5);重铬酸钾-浓硫酸外加热法测定土壤有机质;碱解扩散法测定碱解氮;钼锑抗比色法测定速效磷;火焰光度计测定速效钾。

1.4 土壤微生物DNA 提取及测序

土壤DNA提取参照DNA Kit(MoBio Laboratories Inc. Carlsbad, CA, USA)试剂盒说明书。提取的DNA样本分别用核酸蛋白仪(NanoDrop ND-1000)和1%琼脂糖凝胶电泳进行质量检测。符合要求的样本以ITS1-(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2(5′-TGCGTTCTTCATCGATGC-3′)为引物进行扩增,产物送至北京奥维森基因科技有限公司,利用 Illumina Miseq PE300高通量测序平台测序。

1.5 数据分析

用Microsoft Excel对土壤理化性质数据进行基本计算。测序数据下机后经过QIIME(v1.8.0)软件过滤、拼接和去除嵌合体。根据barcodes归类各处理序列信息聚类为用于物种分类的OTU(Operational Taxonomic Units),OTU 相似性设置为97%[20]。对比Silva数据库,得到每个OTU 对应的物种分类信息[21-22]。利用Mothur 软件(version 1.31.2)进行Alpha多样分析[23]。经过UniFrac算法利用系统进化的信息来比较样品间物种群落差异,并进行Beta多样性分析。采用SPSS 20.0软件进行主成分分析(PCA,Principal Component Analysis),差异显著性水平为P<0.05。采用Canoco5进行RDA分析。

2 结果与分析

2.1 树龄和有机肥施用量对苹果园土壤理化性质的影响

对选取的试验果园土壤理化性质进行分析,结果表明(表1):15年树龄的苹果园土壤pH显著低于5年树龄苹果园,但相同树龄的果园有机肥施用量改变对土壤pH无显著影响,而果园土壤有机质和速效养分含量在不同果园土壤之间也存在差异,有机质含量为15M100>15M50>5M50>5M35,土壤碱解氮含量在不同果园之间表现为15M50>15M100>5M35>5M50。说明随苹果树龄增大,果园土壤pH降低,土壤碱解氮和有机质含量增加,而树龄相同的果园,有机肥的施用量对土壤养分和有机质含量影响较大。

表1 不同苹果园土壤理化性质Table 1 Soil physical and chemistry properties of apple orchard

注:数据为均值±标准差。每列数字后不同字母表示在0.05水平上存在显著差异。5M35,5年树龄,每棵树每年施用有机肥35 kg;5M50,5年树龄,每棵树每年施用有机肥50 kg;15M50,15年树龄,每棵树每年施用有机肥50 kg;15M100,15年树龄,每棵树每年施用有机肥100 kg。下同。

Note: The data are the means ± SE. Values followed by the different letters in each column are significantly different at 0.05 level.5M35 means 5 cultivation years, 35 kg manure per tree per year;5M50 means 5 cultivation years, 50 kg manure per tree per year;15M50 means 15 cultivation years, 50 kg manure per tree per year;15M100 means 15 cultivation years, 100 kg manure per tree per year. The same below.

2.2 种植年限和有机肥施用量对果园土壤真菌群落多样性的影响

基于高通量测序结果,所有土壤真菌Coverage值均>99%,说明该测序结果代表了果园土壤样本中真菌的组成。施肥量相同时,种植15年的苹果园土壤真菌Chao1高于5年果园土壤,而Shannon指数在不同种植年限果园土壤中未发生显著变化(表2),说明随着种植年限增加,果园土壤真菌丰富度有所增加。比较而言,有机肥的施用量对种植幼龄树(5年)果园的土壤真菌丰富度(Chao 1)有显著影响,而对于15年树龄的果园来讲,施用量会显著影响土壤真菌的多样性(Shannon)(表2)。

2.3 不同处理土壤真菌群落组成

通过数据标准化,最终得到1 307个OTUs,对OTUs在不同分类水平上进行注释,结果表明苹果园土壤真菌主要包括7门、21纲、55目和92属。从门的分类水平看,苹果园土壤真菌归属于子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、接合菌门(Zygomycota)、芽枝霉门(Blastocladiomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)、丝足虫门(Cercozoa)和壶菌门(Chytridiomycota),其中子囊菌门(39.97%~78.75%)和担子菌门(10.25%~49.61%)为苹果园土壤真菌群落的优势菌种(图1(a))。

表2 苹果园土壤真菌Alpha多样性Table 2 Alpha diversity of fungi in apple orchards

对比不同处理间的差异性发现,作为优势菌种的子囊菌门和担子菌门,其在有机肥施用量不同的15年树龄果园土壤中的相对丰度较稳定,而在5年树龄果园的土壤中变化显著:子囊菌门相对丰度在5M35和5M50果园分别为40.49%和78.75%,担子菌门相对丰度在5M35和5M50果园分别为49.61%和10.25%(图1(a))。说明有机肥施用量可显著改变优势菌的分配,子囊菌门相对丰度随有机肥施用量增加而增加,担子菌则呈现相反趋势。相对应的,有机肥施用量对15年树龄果园土壤真菌群落组成的影响则主要体现在非优势菌群(图1),尤其是球囊菌,其相对丰度在15M100处理中为0.11%,而在15M50中几乎不存在(0.009 7%),另外丝足虫在15M50和15M100间差异也较大,相对丰度分别为0.31%和0.05%(图1(b))。

图1 苹果园土壤真菌群落组成
Fig.1 Relative abundance of soil fungal community at phyla level

进一步从属水平分析发现,树龄和有机肥施用量对苹果园土壤真菌群落的组成比例均有影响(图2)。对得到的OTU进行Kruskal-Wallis检验发现,其中86个OTU存在显著差异,经注释可知这些差异OTU分别归类在11个属种,其中Guehomyces属占比最多,之后依次为沃德霉菌属Wardomyces、伞菌属Agaricus、腐质霉菌属Humicola和柄孢壳菌属Podospora(图2)。而对优势真菌(RA>1%)在不同果园之间分析发现(表3),果园土壤真菌沃德霉菌属Wardomyces和Guehomyces的相对丰度在不同树龄和不同有机肥施用量之间均存在差异,而被孢霉菌属Mortierella相对丰度随树龄增加而增加。另外,毛壳菌属Chaetomium在15M100处理中相对丰度为4.53%,在15M50处理中降低到1.67%,即在成龄果园中,该菌种相对丰度随有机肥施用量增加而增加。同样的,隐球菌属Cryptococcus在5M50处理中相对丰度为2.32%,在5M35处理中降低到1.40%,即在幼龄果园土壤中,随有机肥施用量增加该菌相对丰度降低。而假霉样真菌属Pseudallescheria和镰刀菌属Fusarium相对丰度在4个处理之间无差异。

图2 苹果园土壤真菌前20种属热图
Fig.2 Heatmap of top 20 soil fungal genus in apple orchard

表3 苹果园土壤真菌属相对丰度(RA>1%)
Table 3 Relative abundance of fungal dominant genera in apple orchards (RA>1%) %

门Phyla属Genera处理 Treatment5M355M5015M5015M100Pseudallescheria5.28±0.37 a8.50±0.38 a6.29±0.10 a2.76±0.38 aAscomycotaWardomyces2.95±0.70 a0.13±0.04 b2.15±0.37 a0.49±0.08 bFusarium0.90±0.24 a1.96±0.68 a1.55±0.59 a1.36±0.42 aChaetomium2.15±0.70 ab3.66±0.04 a1.67±0.30 b4.53±0.80 aBasidiomycotaCryptococcus1.40±0.17 b2.32±0.54 a3.11±0.74 a2.29±0.03 abGuehomyces45.32±1.20 a6.37±3.60 c29.83±1.86 b40.88±2.35 aZygomycotaMortierella3.10±0.51 b3.30±0.02 b5.27±0.63 a6.55±0.63 a

2.4 不同处理土壤真菌群落结构分析

对1 307个OTUs进行分析通过Venn图呈现不同样本组间共有和独有OTU数量。结果表明所有处理均含有相同的348个OTUs,5M35、5M50、15M50 和15M100独有OTU个数分别为60、112、98和71。共有OTUs的数量可代表样本之间的真菌群落组成相似度,15M50和15M100共有总数(595个OTUs)大于5M35和5M50共有总数(518个OTUs)(图3(a)),说明果园树龄越大,土壤真菌群落的相似度越高。施肥量相同时,种植5和 15年的苹果园OTU数量分别为773和827,共有OTU数量为491,说明不同树龄果园土壤真菌组成相似度较低,并且土壤真菌丰富度随树龄增加而增加(表2)。

基于OTU(97%相似水平)丰度进行PCA分析用于反应不同处理的差异。果园土壤真菌在OTU水平的PCA分析表明第一主成分和第二主成分对样本差异的贡献值分别为58.87%和16.89%,5M35、5M50、15M50和15M100共4组样品表现为组内聚集,组间有明显的分离(图3(b))。在第二主成分上4组样品可以分为2组(5M50、15M100 和5M35、15M50),表明有机肥施用量明显改变了果园土壤真菌群落结构。

(a)OTUs的韦恩图Venn chart of OTUs;(b)主成分分析 Principal component analysis.
图3 苹果园土壤真菌群落结构
Fig.3 Soil fungal structure

2.5 土壤养分对真菌群落的影响

本试验分析了不同样本土壤中真菌群落与土壤理化性质及苹果果实品质之间的关系,图4中点代表样本,黑色箭头代表土壤真菌,红色箭头代表土壤理化性质,棕色箭头代表果实品质(图4)。真菌与土壤理化性质的冗余分析表明(图4(a)),3种主要的真菌(毛壳菌属、假霉样真菌属和镰刀菌属)与土壤速效养分和有机质含量存在正相关关系,而与pH呈负相关。相反,在苹果园土壤中,沃德霉菌属Wardomyces和Guehomyces属与土壤pH呈显著正相关关系,与土壤有机质、速效磷和碱解氮呈负相关。微生物与苹果果实品质的冗余分析表明(图4(b)),毛壳菌属和假霉样真菌属在果实品质中的发挥正向的作用,尤其是可滴定酸和可溶性糖,而沃德霉菌属Wardomyces和Guehomyces属均与果实可滴定酸呈显著负相关关系。

3 讨 论

SOM,土壤有机质 Soil organic matter; AN,碱解氮 Alkali-hydrolyzable N; AP,速效磷 Available P; AK,速效钾 Available K
图4 苹果园土壤中真菌群落与土壤理化性质(a)和苹果果实品质(b)的冗余分析
Fig.4 RDA of soil properties (a), fruit quality (b) and soil fungal dominant genera in apple orchards

北京地区苹果种植有机肥施用范围较广泛,通过对不同树龄和有机肥施用量的果园土壤调查发现,成龄苹果园土壤pH低于幼龄果园。有报道表明多年生果园土壤受根系分泌的有机酸等物质影响,pH会随树龄增加逐步降低[24]。而成龄苹果园土壤速效养分含量高于幼龄果园,与姜远茂等[25]对山东苹果园土壤养分状况调查结果趋势相同。同时,施肥方式对不同树龄果园土壤真菌多样性和群落结构的影响不一致[26],对于幼龄果园,有机肥的增施对真菌丰富度造成较大的影响,而成龄果园增施的有机肥在一定程度上增加了土壤肥力,对真菌群落组成并未存在显著影响。试验地苹果园土壤的真菌主要由子囊菌门、担子菌门和接合菌门组成,这与在茶园和枸杞等多年生作物的研究中类似[27-28]。土壤真菌总数量随着果树的树龄增大而增大,其原因在于植物的生长过程改变了土壤中的菌群组成[29]。子囊菌门和担子菌门在幼龄果园受有机肥施用量的影响更明显,真菌属水平分析结果表明增施有机肥降低真菌沃德霉菌属Wardomyces和Guehomyces属在果园土壤中的相对丰度,而这2种菌与土壤速效养分存在负相关关系,与苹果可滴定酸也存在负相关关系。毛壳菌属在成龄果园中受有机质调控,并且对果实品质有显著的正向调控。在生态系统中,土壤微生物参与植物残体的分解,从而推动土壤中碳、氮循环过程,是土壤养分循环的动力[30]。

本研究通过对北京地区苹果园内土壤真菌组成及其多样性指数对比发现,北京地区苹果园内的真菌多样性稳定,其中非致病真菌占比较大,可能是因为根系活力随着树龄的增大而减弱,细菌和放线菌的减少增加了真菌的含量,同时根系分泌的酚酸类物质增多,长期以往则会造成一些与土传病害相关的真菌[31-32](如柱孢属Cylindrocarpon及镰刀菌属Fusarium等)占比增加,从而造成连作障碍的发生[33-35]。果园土壤中真菌菌群相互制约,存在与植物相关的促生菌与致病菌,例如:毛壳菌和漆斑菌属Myrothecium等对苹果黑星病及根结线虫杂草等有拮抗作用[36],而Rhizophagus和木霉菌属Trichoderma可以与植物互惠共生。但随着树龄增加,有益菌占比下降,而致病菌(轮枝菌属Verticillium、赤霉菌属Gibberella和茎点菌属Phoma)增多。

苹果树生长过程中需要从土壤中汲取大量的营养元素,因此果园每年投入肥料维持树体生长,不平衡的肥料施用进一步加快了土壤退化的速度,而果园通过有机肥施用影响了植物与微生物之间的关系,也降低土壤中有害的酚酸类物质,减少作物的自毒作用[37-38]。植物与真菌的互作机理,以及近半数功能未知的真菌群落有待进一步的研究与分析。今后我们也希望通过对有机肥的施用以及土壤真菌组成的分析,为今后降低肥料的使用,通过检测真菌组成监测土壤环境的状态及质量,以及通过利用菌群间的互作关系,改变土壤菌群组成,从而改善土壤环境及树体长势,并进一步预测果实品质提供有益的参考。

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