基于药效学效果结合化学指标优选小儿汗停颗粒提取工艺

王伦，朱丽玲，邹荣，吴宁，许汉林

(1.湖北中医药大学药学院，武汉 430065；2.武汉军谷坊科技开发有限公司，武汉 430075)

气虚型自汗、盗汗是儿科临床上的常见病，治宜补气，固表止汗。小儿汗停颗粒方由黄芪、炒白术、防风、煅牡蛎、麻黄根等5味药组成，在玉屏风散[1]及牡蛎散[2-4]基础上化裁而成，是湖北省武穴市某医院的临床经验方，疗效确切。该方君药黄芪以皂苷、黄酮类成分为主要目标成分，其皂苷类代表性成分黄芪甲苷和黄酮类的代表性成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷，作为本品的指标性成分[5-6]，利用全方水提、水提+提挥发油、部分醇提、水提醇沉4种工艺路线[7-11]，通过正交设计，以指标性成分的转移率和收膏率为指标，确定黄芪等四味药的最佳水提取工艺，以现代药效学研究中对大鼠足跖部皮肤汗点的作用，筛选出指标成分最高、疗效最好的制备工艺[12-14]，旨在为小儿汗停颗粒的生产提供理论依据。

1 动物、试药与仪器

1.1实验动物 SD大鼠，体质量180～220 g，雌雄各半，无特定病原体(SPF)级，由湖北省实验动物研究中心提供，许可证号：SCXK(鄂)2008-0005。大鼠饲养于SPF级动物房，温度24～28 ℃，湿度50%～60%，饲料按照《实验动物小鼠大鼠配合饲料》进行配制，饮水为纯净水。

1.2药物与试剂 小儿汗停颗粒A、B、C、D，由武汉军谷坊科技开发有限公司提供，分别用纯化水配成10%和20%的溶液备用；虚汗停颗粒，广州奇星药业有限公司，批号：2087；蓖麻油，湖北科田药业有限公司，批号：130102；硝酸毛果芸香碱滴眼液，沈阳兴齐眼药股份有限公司，批号：130801；硫酸阿托品注射液，上海禾丰制药有限公司，批号：110901B；无水乙醇，国药集团化学试剂有限公司，批号：20090224；碘剂，天津博迪化工股份有限公司，批号：20120901；可溶性淀粉，天津市福晨化学试剂厂，20080602。

1.3仪器 高效液相色谱仪(LC-20AT，日本岛津公司)；40KHZ超声波清洗机(洁拓电子有限公司)；万分之一电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；旋转蒸发器(长城科工贸有限公司)；中药粉粹机(旭朗机械设备有限公司)；DZF-6050型真空干燥箱(博迅实业有限公司)。

2 实验方法

2.1工艺路线设计 本方为中医经典方玉屏风散合牡蛎散化裁而成，本品功能主治为益气固表、敛阴止汗。适用于小儿自汗、盗汗属气阴两虚症。文献报道，中医的气虚与机体的免疫功能低下有关。卫气的防御作用是卫气的重要功能之一，其理论建筑在《内经》“阳因而上，卫外者也”、“阳者，卫外而为固也”(《素问·生气通天论》)及“卫气不营，邪气居之”(《灵枢·上膈篇》)等论述基础上。近年来，有关卫气防御作用的研究取得了较多的成果，主要表现在卫气防御作用与现代免疫学之间的关联得到了初步的阐明。根据本品功能主治及方中各药味所含成分的分析，笔者以各药味中具有调节免疫作用的成分为目标，并参考《中华人民共和国药典》2010年版一部玉屏风颗粒和部标十四册虚汗停颗粒制法项下方法，进行提取工艺路线的设计，方案如下。

工艺路线一(A)：取方中牡蛎按正交实验确定的最佳工艺提取，加6倍量水，煎煮3次，每次1 h，滤过，合并滤液备用；将其余黄芪等四味药加水提取，滤过，滤液与上述牡蛎滤液合并，减压浓缩至稠膏，减压干燥，得干膏。通过正交设计，以指标性成分的转移率和收膏率为指标，确定黄芪等4味药的最佳水提取工艺。

工艺路线二(B)：取方中牡蛎按正交实验确定的最佳工艺提取(同线路一)，提取液滤过，滤液备用；另取黄芪、防风加一定浓度的醇回流提取，合并醇提液，滤过，滤液备用，药渣与白术、麻黄根两味药按正交实验确定的最佳水提工艺提取，提取液与上述两滤液合并，减压浓缩至稠膏，减压干燥，得干膏。通过正交设计，以指标性成分的转移率和收膏率为指标，确定黄芪、防风的最佳醇提工艺。

工艺路线三(C)：取方中五味药，加6倍量水，煎煮3次，每次1 h，合并滤液，减压浓缩至药材-清膏比(1.5：1)(相对密度1.17～1.18，50 ℃)，加95%乙醇至含醇量为50%，静置36 h，分离上清液，下层抽滤得滤液，滤液与上清液合并，减压回收乙醇并浓缩至稠膏，减压干燥至干膏。通过正交设计，以指标性成分的转移率和收膏率为指标，确定最佳的醇沉工艺。

工艺路线四(D)：取方中牡蛎按正交实验确定的最佳工艺提取(同线路一)，提取液滤过，滤液备用；将防风、炒白术，按正交实验确定的最佳挥发油提取工艺，提取挥发油，备用，提取液滤过，滤液备用；取黄芪、麻黄根按工艺一确定的最佳条件提取，滤过，滤液与上述两滤液合并，浓缩至稠膏，减压干燥至干膏，喷入挥发油。

取2/5处方量药材4份，分别按照以上确定的四条工艺路线提取得干膏，并制得药效学研究实验的样品，结果见表1。

表1 药效学实验样品制备

按干膏总量的70%取四条工艺路线所得的干膏粉，分别加淀粉至210 g，充分混匀，其中工艺路线四混匀后喷入提取所得挥发油，混匀，密闭过夜。所制得的样品，每1 g药粉相当于生药 3.3 g。

2.2药效学研究

2.2.1分组及给药 取SD大鼠96只，适应性喂养3 d后随机分为12组：正常对照组，模型对照组，小儿止汗停颗粒，A工艺小、大剂量组，B工艺小、大剂量组，C工艺小、大剂量组，D工艺小、大剂量组，阳性对照组(即虚汗停组和阿托品组)。A、B、C、D工艺小、大剂量组分别灌胃给予10%，20% A、B、C、D制剂溶液，剂量为1 mL·(100 g)-1，虚汗停组灌胃给予虚汗停溶液7.5 g·kg-1，正常对照组和模型对照组灌胃给予等容量纯化水，每天2次，连续7 d。阿托品组最后一次给药时皮下注射阿托品0.25 mg·kg-1。

2.2.2实验方法 末次给药后30 min，参照文献方法改进后进行实验：除正常对照组大鼠外，各组大鼠分别皮下注射1 mg·kg-1毛果芸香碱。用硬纸板固定所有大鼠，暴露固定右后肢，用棉签蘸取无水乙醇轻轻将足跖部污物擦洗干净。15 min后，用干净棉签将各组大鼠足跖部原有的和由于固定时挣扎所致的汗液轻轻拭干，于大鼠足跖部皮肤涂上和田-高垣氏试剂A液，待充分干燥后，再薄薄涂上B液，分别于10和20 min用相机摄影，在电脑上计数深紫色着色点(即汗点)出现的数量。

3 结果

各组大鼠排汗情况见表2。动物造模后，各时间点的汗点均有明显增多，与正常组比较均差异有统计学意义(均P<0.05)。

与模型对照组比较，A、B、C、D 4种工艺所制的小儿汗停颗粒均有减少大鼠足跖部皮肤汗点的作用，其中A、D工艺所制的小儿汗停颗粒有显著减少大鼠足跖部皮肤汗点的作用。

可见，A、B、C、D工艺获得的制剂D工艺效果最好，A工艺次之，B、C工艺与模型对照组相比，汗点较少，但无显著性差异，止汗效果不明显，故D工艺即水提醇沉工艺为最佳工艺。

表2 各组大鼠排汗情况比较

Tab.2Comparisonofsweatingineachgroupofrats

组别大鼠/只10 min汗点20 min汗点正常对照组8 220.63±40.84231.13±41.93模型对照组6 274.17±42.39① 286.33±46.67①虚汗停组8 184.00±49.52② 192.13±51.89②阿托品组8 0.00±0.00② 0.00±0.00②A工艺 小剂量组8 213.63±54.73③234.25±55.49③ 大剂量组8 208.00±40.51③222.50±43.75③B工艺 小剂量组8 238.00±48.07255.13±48.41 大剂量组7 237.71±54.79249.00±55.37C工艺 小剂量组7 234.00±30.23244.00±32.93 大剂量组8 249.50±30.65262.00±28.77D工艺 小剂量组8 200.88±41.06②213.88±40.17② 大剂量组7 192.71±32.44②209.14±33.98②

①与正常对照组比较，F=15.12，15.41，P<0.05；②与模型对照组比较，F=12.76～17.67，P<0.01；③与模型对照组比较，F=14.25～15.61，P<0.05。

①Compared with the normal control group，F=15.12，15.41，P<0.05； ②Compared with the model control group，F=12.76-17.67，P<0.01； ③Compared with the model control group，F=14.25-15.61，P<0.05.

4 讨论

由小儿汗停颗粒处方中各味药可以看出，本方君药黄芪所含的皂苷、黄酮、多糖类成分均有免疫调节的作用[15-17]，从目前已上市的中成药玉屏风颗粒和虚汗停颗粒的处方和制法分析，其均含黄芪，且均采用水提醇沉工艺，以皂苷、黄酮类成分为主要目标成分，兼顾部分多糖类成分的提取[18-20]。《中华人民共和国药典》2010年版一部中黄芪药材分别测定了皂苷类的代表性成分黄芪甲苷和黄酮类的代表性成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷，笔者亦选用了此两成分作为本品的指标性成分。白术内酯、挥发油、多糖均有与本品功能主治相关的药理作用，通过不同的工艺路线进行筛选，防风所含的色原酮类成分升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷以及挥发油类成分是其有效成分，但对本品的功能主治来说，不是主要的药效成分，将其作为参考指标，其多糖类成分具有明显的增强机体免疫功能的作用，与本品功能主治相关。麻黄根和煅牡蛎根据现有的文献报道，其起效机制和成分并不明确，以收膏率作为其考察指标。从药效学实验样品制备可知，指标性成分黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄苷的转移率，均为水提醇沉工艺最高，全方水提工艺次之，与药效学实验结果相符。

药效学实验结果表明，小儿汗停颗粒最佳工艺为水提醇沉法，原料价廉易得且易于控温，但水提醇沉法也有一些不足：水的极性大，在提取多糖类指标性成分时，容易将植物体所含的脂质和蛋白质一同提取出来，并且都被乙醇沉淀，从而减少非有效成分的含量。水提醇沉法对温度也有一定的要求，冷却后加入醇，加入的方式是慢加快搅，若未等到药液冷却便加入乙醇，则会导致乙醇受热损失，局部醇浓度过高造成有效成分被包裹而损失。药效学实验研究的不足之处在于对大鼠足跖部皮肤汗点的计数上，本实验采用的方法是于大鼠足跖部皮肤分别涂抹和田-高垣氏试剂A液和B液，分别于10 min和20 min用相机拍照，在电脑上计数深紫色着色点(即汗点)出现的数量，由文献方法优化而来，此方法对于汗点的技术精确度不高，而且人为计数误差较大，目前笔者尚未见更准确可靠的方法对大鼠皮肤汗点进行计数，故有待进一步研究。